Studien zur Regulation der Clusterin-Expression in der MCF-7- und MDA-MB-231-Mamma-Karzinom-Zelllinie

Pinell, Nicole Maria; Krusche, Claudia Astrid

doi:urn:nbn:de:hbz:82-opus-32408

Studien zur Regulation der Clusterin-Expression in der MCF-7- und MDA-MB-231-Mamma-Karzinom-Zelllinie = Regulation of clusterin expression in MCF7 and MDA-MB-231 breast cancer cells

Pinell, Nicole Maria (Author)

2010

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Nicole Maria Pinell

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2010

UmfangVI, 102 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2010

Genehmigende Fakultät
Fak10

Hauptberichter/Gutachter
Krusche, Claudia Astrid (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2010-03-25

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-32408
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/51755/files/3240.pdf

Einrichtungen

Lehrstuhl für Molekulare und Zelluläre Anatomie (511001-4)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Brustkrebs (Genormte SW) ; Genregulation (Genormte SW) ; Medizin (frei) ; Clusterin (frei) ; MCF-7-Zellen (frei) ; MDA-MB-231-Zellen (frei) ; clusterin expression (frei) ; MCF7 cells (frei) ; MDA-MB-231 cells (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 610

Kurzfassung
Das sekretorische Clusterin (sCLU) besteht aus einer je 38 kDa schweren, glykosylierten alpha- und beta-Kette, welche durch die Spaltung der 65 kDa schweren Vorläuferform des sCLU entstehen. sCLU wird u.a. von apoptotisch sterbenden Zellen produziert und wirkt antiapoptotisch. Beim Mamma-Karzinom korreliert seine Überexpression mit einem hohen Malignitätsgrad. Da wenig über die hormonelle Regulation der Clusterin-Expression im Mamma-Karzinom bekannt ist, wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht, ob die Clusterin-Expression in Mamma-Karzinom-Zelllinien einer Regulation durch Steroidhormone unterliegt. Außerdem wurde analysiert, ob die Clusterin-Expression durch Trichostatin A (TSA), einen tumorwachstumshemmenden Histondeacetylase(HDAC)-Inhibitor, verändert wird. Parallel sollte der Einfluss von TSA auf das Auftreten der zellulären Seneszenz, das Überleben der Zellen und die p21-Expression, die durch zytostatisch und apoptotisch wirkende Substanzen beeinflusst wird, untersucht werden. Die mRNA- und Protein-Expression wurde mittels Real-Time RT-PCR, Western Blot-Analytik und Immunhistochemie in MDA-MB-231- und MCF-7-Mamma-Karzinom-Zellen a) nach Kultivierung mit Estradiol (E2) und E2 in Kombination mit verschiedenen Gestagenen (Medroxyprogesteronacetat, R5020 oder Megestrol-Acetat), b) nach 48-stündiger Behandlung mit verschiedenen TSA-Dosierungen (0.2, 0.5, 0.75, 1 und 2 µM/L) und c) nach Behandlung mit 0,5 µM/L TSA für 0 bis 96 Stunden untersucht. Beide Zelllinien exprimierten nach Kultivierung mit und ohne Steroidhormone lediglich die 65 kDa schwere Vorläuferform des sCLU. Weder durch E2 noch durch E2 in Kombination mit Gestagenen wurde das Ausmaß der Clusterin-mRNA- und -Protein-Expression beider Zelllinien signifikant beeinflusst, so dass die Clusterin-Expression in MDA-MB-231- und MCF-7-Zellen keiner hormonellen Regulation unterliegt. Damit unterscheiden sich MDA-MB-231- und MCF-7-Zellen - wenn auch aus unterschiedlichen Gründen - von der T47D-Mamma-Karzinom-Zelllinie, die in früheren Studien analysiert wurde. Durch TSA-Konzentrationen >= 0,2 µM/L wurde in MCF-7- und MDA-MB-231-Zellen die zelluläre Seneszenz, die mit einer Inhibition der Proliferation einhergeht, induziert. Darüber hinaus zeigten TSA-Konzentrationen > 0,5 µM/L zusätzlich einen deutlichen zytotoxischen Effekt, was durch die kontinuierliche Reduktion der Zellzahl während der Kultivierung deutlich wurde. In diesem Zusammenhang konnte gezeigt werden, dass die p21-Expression durch TSA-Dosierungen von 0,5 µM/L in MDA-MB-231-Zellen dauerhaft, in MCF-7-Zellen hingegen nur nach 12- und 24-stündiger Inkubation signifikant gesteigert wurde. MCF-7- und MDA-MB-231-Zellen unterscheiden sich auch in der Prozessierung des Clusterins. In den Zellextrakten der MCF-7-Zellen konnten nach TSA-Behandlung neben der 65 kDa schweren Vorläuferform auch die 38 kDa schweren Ketten des reifen sCLU nachgewiesen werden. Unter den experimentellen Bedingungen dieser Arbeit wurde in MDA-MB-231-Zellen nur die 65 kDa schwere Vorläuferform gefunden, während die 38 kDa schweren Ketten des reifen sCLU auch nach einer TSA-Behandlung nicht detektiert werden konnten. Zusätzlich fällt auf, dass eine signifikante Steigerung der Clusterin-Expression in MDA-MB-231-Zellen durch verschiedene TSA-Dosierungen, in MCF-7-Zellen aber durch verschiedene TSA-Inkubationszeiten erzielt wird. Obwohl der Clusterin-Expressions-„Peak“ in MCF-7-Zellen zeitlich mit dem Peak der p21- Expression zusammenfällt, konnte mit der Clusterin-p21-Immundoppelmarkierung weder in MCF-7- noch in MDA-MB-231-Zellen ein kausaler Zusammenhang zwischen p21- und Clusterin-Expression nachgewiesen werden, was im Gegensatz zu publizierten Studien an Kolon-Karzinom-Zellen steht. Zusammenfassend kann man feststellen, dass interessanterweise die Prozessierung des Clusterin-Proteins unter der Kultivierung mit dem HDAC-Inhibitor TSA in den untersuchten Mamma-Karzinom-Zelllinien deutliche Unterschiede aufweist. In Folgestudien sollte nun geklärt werden, ob die verschiedenen Mamma-Karzinom-Zelllinien unterschiedlich empfindlich auf die zytotoxische Wirkung von TSA und in der Klinik verwendeten HDAC-Inhibitoren reagieren und ob die Empfindlichkeit mit der Clusterin-Isoform-Expression und -Prozessierung korreliert.

The secretory form of the clusterin protein (sCLU) consists of a 38-kDa glycosylated alpha- and beta-chain, which arise from the cleavage of the 65-kDa sCLU precursor protein. sCLU is produced in inflamed epithelia and apoptotic cells and inhibits apoptotic cell death. In human breast carcinomas, sCLU overexpression is associated with tumor progression. To date, little is known about the hormonal regulation of clusterin expression in human breast cancer. Consequently, the effects of steroid hormone treatment on clusterin mRNA and protein expression was studied in two breast carcinoma cell lines. Moreover, it was analyzed, if clusterin expression is influenced by the histone deacetylase (HDAC) inhibitor Trichostatin A (TSA), which inhibits tumor growth. In addition, we assessed the effect of TSA on the induction of p21 expression, cellular senescence and cell survival, all processes known to be influenced by cytostatic agents and apoptosis inducing drugs. mRNA and protein expression were examined by real-time RT-PCR, Western Blot analyses and immunohistochemistry in MDA-MB-231 and MCF7 breast cancer cells a) after cultivation with 17beta-estradiol (E2) and E2 in combination with different progestins (medroxyprogesterone acetate, R5020 or megestrol acetate), b) after 48 hours of treatment with different doses of TSA (0.2, 0.5, 0.75, 1 and 2 µM/L) and c) after treatment with 0.5 µM/L TSA for 0 to 96 hours. After cultivation with and without steroids, both cell lines expressed the 65-kDa sCLU precursor protein. However, clusterin mRNA and protein expression was not regulated by E2 or E2 in combination with progestins in both cell lines. Consequently, in the MDA-MB-231 and MCF7 breast cancer cell line, clusterin mRNA and protein expression is not subject to hormonal regulation. Therefore, MDA-MB-231 and MCF7 cells differ from T47D breast cancer cells, which show extensive regulation of clusterin mRNA expression and sCLU processing by steroid hormones. TSA doses >= 0.2 µM/L induced cellular senescence in MCF7 and MDA-MB-231 cells, which is accompanied by inhibition of cell proliferation. Moreover, TSA concentrations >= 0.5 µM/L showed a distinct cytotoxic effect, which became apparent by the continuous cell loss during cultivation time. In this context, it was shown that TSA treatment (0.5 µM/L) permanently increased p21 expression in MDA-MB-231 cells, but only transiently (after 12 and 24 hours of treatment) in MCF7 cells. Additionally, differences in clusterin protein processing were detected in MCF7 and MDA-MB-231 cells. Whereas in TSA-treated MDA-MB-231 cells, only the 65-kDa sCLU precursor protein was detected, in TSA treated MCF7 cells mature sCLU (38-kDa) was found in addition to the 65-kDa sCLU precursor protein. Furthermore, there were differences in the dose response. In MCF7 cells, an increase of clusterin isoform expression was observed only after treatment with 0.2 and 0.5 µM/L TSA, whereas in MDA-MB-231 cells all applied TSA doses raised the expression of the 65 kDa clusterin precursor protein. Clusterin and p21 peak expression coincided in MCF7 cells, however, a causal correlation between clusterin and p21 expression was neither detected in MCF7 nor in MDA-MB-231 cells by clusterin-p21 immunodouble-labeling. This is in contrast to results obtained in colon cancer cell lines. In summary, the presented data show that the studied breast cancer cell lines show differences in clusterin protein processing after cultivation with the HDAC-inhibitor TSA. In following studies, it has to be elucidated, if these different responses are also found by clinically used HDAC-inhibitors and if the cell line specific sensitivity to HDAC-inhibitors correlates with clusterin isoform expression and processing.

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