Die Kontrolle der Transkription in den Mitochondrien des Modellorganismus Schizosaccharomyces pombe

Speer, Falk; Schäfer, Bernd

doi:3275

Die Kontrolle der Transkription in den Mitochondrien des Modellorganismus Schizosaccharomyces pombe = Transcription control in the mitochondria of the model organism Schizosaccharomyces pombe

Speer, Falk (Author)

2010

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Falk Speer

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2010

UmfangIII, 145 S. : graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2010

Zusammenfassung in dt. und engl. Sprache

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Schäfer, Bernd (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2010-03-05

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-32753
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/51787/files/3275.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Transkription <Genetik> (Genormte SW) ; RNS-Spleißen (Genormte SW) ; RNS-Synthese (Genormte SW) ; RNS-Schädigung (Genormte SW) ; Mitochondriale RNS (Genormte SW) ; Messenger-RNS (Genormte SW) ; Ribosomale RNS (Genormte SW) ; Hefeartige Pilze (Genormte SW) ; Schizosaccharomyces pombe (Genormte SW) ; Biowissenschaften, Biologie (frei) ; Pet127p (frei) ; Sls1p (frei) ; Rpm1p (frei) ; Rpm2p (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Die Kenntnisse über die Kontrolle der mitochondrialen Transkription, Prozessierung und Degradation sind bis heute noch lückenhaft, obwohl die Summe der mitochondrial kodierten Gene in vielen verschiedenen Organismen genau identifiziert worden ist. Die Kontrolle der steady state level der Transkripte durch eine Regulation der rudimentären Promotoren ist, anders als bei kernkodierten Transkripten, nicht möglich. Störungen der mitochondrialen Transkription können unter anderem zu Mitochondriopathien führen, eine Klasse von Krankheiten, deren molekulare Hintergründe und Mechanismen in den letzten Jahren zum Ziel einer Reihe ambitionierter Forschungsprojekte geworden sind. Das mitochondriale Genom von Schizosaccharomyces pombe ist im Gegensatz zu dem von Saccharomyces cerevisiae sehr kompakt organisiert und dadurch dem des Menschen wesentlich ähnlicher. Deshalb ist die Spalthefe in diesem Fall als Modellorganismus besser geeignet. Um einen ersten Überblick über die Transkriptionskontrolle in den Mitochondrien zu gewinnen, wurde der Wildtypstamm mit verschiedenen Kohlenstoffquellen bei diversen Temperaturen untersucht. Durch ein neu etabliertes Transkriptom-profiling mittels quantitativer Real Time PCR konnte gezeigt werden, dass sowohl dereprimierende Kohlenstoffquellen als auch Hitzestress zu deutlichen Steigerungen der steady state level mitochondrialer Transkripte führen. In beiden Fällen standen den deutlichen Zunahmen der mitochondrialen steady state level (>Faktor 6) nur geringfügige Änderungen der Expression von kernkodierten Genen gegenüber (Faktor 4) kam. Um Gene zu identifizieren, die an der Kontrolle des mitochondrialen Transkriptoms beteiligt sind, wurden Mutanten untersucht, die die Fähigkeit, auf nicht-fermentierbaren Kohlenstoffquellen zu wachsen, ganz oder teilweise verloren hatten. Durch Komplementation mittels DNA-Banken konnten unter anderem der offene Leserahmen (ORF) SPCC1183.03c identifiziert werden, der als Sp-pet127 bezeichnet wurde. Die Disruption dieses Gens reduziert die Fähigkeit, nicht-fermentierbare Kohlenstoffquellen bei erhöhter Temperatur zu nutzen. Bioinformatische Untersuchungen konnten zeigen, dass in über 60 weiteren Organismen Gene mit einer hohen Homologie zu dem untersuchten ORF existieren. Die qualitative Analyse des mitochondrialen Transkriptoms der Disruptante führte zu keinen Hinweisen auf Prozessierungsdefekte, so dass eine Beteiligung an der Transkript-Prozessierung in S. pombe ausgeschlossen werden konnte. Die steady state level der meisten mitochondrialen Transkripte erfuhren durch die Disruption des Gens eine starke Steigerung, während die Überexpression des Leserahmens zu einer deutlichen Reduktion führte. Da Homologe in Organismen auftreten, bei denen mitochondrial keine Polyadenylierung stattfindet, wurde angenommen, dass dieses Gen eine weitere Möglichkeit darstellt, die Transkriptstabilität in den Mitochondrien zu regulieren. Die Kontrollfunktion wird über das 5´-Ende der Transkripte ausgeübt und Defekte in diesem Bereich führen zu einer verstärkten Degradation der RNAs. Die heterologe Expression des Leserahmens SPCC1183.03c konnte die Disruption des Homologs in S. cerevisiae, PET127 komplementieren. Durch die Überexpression von Sp-pet127 in verschiedenen Disruptanten konnte nachgewiesen werden, dass ein mitochondrial lokalisierter Komplex aus einer Helikase (rpm2) und einer RNase (rpm1) zwar die Prozessierung der Transkriptenden gewährleistet, aber die allgemeine Degradation von diesem Komplex unbeeinflusst ist. Ein weiteres Gen, das das Transkriptom beeinflusst, war der ORF SPAP8A3.14c (Sp-sls1). Die Disruption führte zu einem kompletten Atmungsdefekt. Untersuchungen des mitochondrialen Transkriptoms zeigten, dass es besonders bei den Mosaikgenen cox1 und cob zu einer massiven Reduktion der steady state level kam. Durch Verwendung eines mitochondrial intronlosen Stamms wurde deutlich, dass die beobachtete Abnahme nicht durch fehlerhafte Intron-Prozessierung verursacht wurde, sondern auf eine mangelhafte Stabilisierung der Transkripte zurückzuführen war. Hierfür spricht unter anderem, dass Sp-sls1 in der Lage ist, fehlerhaft prozessierte cob-Transkripte zu stabilisieren und so deren steady state level zu erhöhen, unabhängig davon, an welchem Ende der Transkripte die Defekte auftraten. Durch die Charakterisierung von Sp-pet127 und Sp-sls1 konnte das Verständnis der mitochondrialen Transkriptionskontrolle durch diese Arbeit um wichtige Aspekte erweitert werden.

Genes encoded by the mitochondrial genome were characterised in various organisms, but many aspects of transcription, processing and degradation are poorly understood. The steady state level of mitochondrial transcription can not be controlled by regulation of the rudimentary promoters, in contrast to the nuclear encoded genes. The disturbance of mitochondrial transcription can lead to the development of mitochondriopathies. The molecular mechanisms of this class of diseases have become a target of ambitious research projects. Regarding the mitochondrial genome organisation, there are higher similarities between human and Schizosaccharomyces pombe than between human and Saccharomyces cerevisiae, making fission yeast the more suitable model organism. To get a first impression of the transcription-control in mitochondria, the Wild type grown on different carbon sources at various temperatures was investigated. By a newly established transcriptome profiling, using quantitative Real time PCR, it could be shown, that derepressing conditions as well as heat stress led to an increase of mitochondrial steady state levels. In both cases the increase of the mitochondrial steady state levels (> factor 6) was stronger than the accumulation of nuclear transcripts of genes influencing the mitochondrial transcriptome (< factor 2). The combination of this conditions led to an increased demand of mitochondrial transcription resulting in increased steady state levels of nuclear encoded transcripts (> factor 4). Mutants which partly lost the ability to grow on non-fermentable carbon source were analysed to identify genes involved in the control of the mitochondrial transcriptom. Using DNA-libraries to complement the growth defects, the open reading frame (ORF) SPCC1183.03c, called Sp-pet127, was identified. The disruption of this gene decreased the ability to grow on non-fermentable carbon sources at elevated temperatures. Bioinformatic investigations showed that homologues of this gene are present in over 60 organisms. Qualitative analysis of the mitochondrial transcriptome of the disruptant indicated no processing defects in S. pombe. The disruption of this gene resulted in a strong increase of most of the mitochondrial transcripts while the overexpression of this ORF led to a decrease of the steady state levels. Because homologs of Sp-pet127 were found in organisms lacking polyadenylation of mitochondrial transcripts, these genes present another possibility to regulate transcript stability. The 5´-end of the transcripts is decisive for the control and defects at this end led to an enhanced degradation. The heterologe expression of Sp-pet127 in S. cerevisae complemented the effects of the disruption of S. cerevisiae homolog PET127. By overexpressing this Sp-pet127 in different disruptants, it could be shown that a mitochondrially localised complex consisting of a Helikase (rpm2) and an RNase (rpm1) is responsible for the generation of the ends of the mature transcripts, but not involved in general RNA turnover. Another gene, which was analysed in detail, was the ORF SPAP8A3.14c (Sp-sls1). The disruption lead to a total loss of respiration and the investigation of the mitochondrial transcriptome showed that especially the steady state levels of intron-containing genes like cox1 and cob are strongly decreased. By the use of a mitochondrially intronless strain, it could be shown that the observed reduction was not induced by intron-processing defects, but a lack of transcript stabilisation. This theory is supported by the observation that Sp-sls1 is able to stabilise incorrect processed transcripts of cob increasing the steady state level, regardless which end(s) showed processing defects. New important aspects of the knowledge about mitochondrial transcription control could be gained by analysing involved genes in this work. Sp-pet127 was identified as a factor involved in control of transcript quality and Sp-sls1, is a gene which stabilises certain transcripts and is crucial in coordination of transcription and translation.

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