guest ::
Cloning and targeted deletion of the mouse histidine rich glycoprotein gene and functional characterization of HRG in mice = Klonierung und gene targeting des murinen Gens für Histidin-reiches Glykoprotein (HRG) und funktionelle Charakterisierung von HRG in der Maus
2005
Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2005
Genehmigende Fakultät
Fak01
Hauptberichter/Gutachter
Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2005-11-07
Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-12880
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/52018/files/Tsuchida-Straeten_Nobuko.pdf
Einrichtungen
Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Biowissenschaften, Biologie (frei) ; HRG (frei) ; Klonierung (frei) ; Knockout (frei) ; Blut-Koagulation (frei) ; Fibrinolyse (frei) ; cloning (frei) ; knockout (frei) ; blood coagulation (frei) ; fibrinolysis (frei)
Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570
Kurzfassung
Humanes Histidin-reiches Glykoprotein (HRG) ist ein einkettiges Glykoprotein, das in relativ hoher Konzentration von bis zu 150 mg/L ( ~ 2 µM) im Blut zirkuliert. HRG hat ein Molekulargewicht von ca. 67 kD und setzt sich aus 507 Aminosäuren zusammen. Durch seine strukturelle Ähnlichkeit mit Fetuin A, Fetuin B und Kininogen gehört es zu der Cystatin-Superfamilie. HRG wird ausschließlich in der Leber synthetisiert. Es wird in Megakaryozyten und Thrombozyten gespeichert, von denen es nach Thrombin Stimulation ausgeschüttet wird. HRG spielt eine regulatorische Rolle bei der Hämostase und Fibrinolyse und fungiert als Modulator der angeborenen Immunität. Diese Funktionen von HRG konnten bisher nur in vitro beobachtet werden. Seine physiologische Rolle ist jedoch noch nicht bekannt. Um die in vivo Funktionen von HRG auf zu klären, haben wir das HRG-Gen der Maus kloniert und eine HRG-Knockout Maus erzeugt. Zunächst wurden übergreifende Phagenklone, die das murine HRG-Gen enthielten, isoliert und subkloniert. Eine komplette Nukleotid-Sequenz mit 13.591 Basen wurde bestimmt (Tsuchida, Masterarbeit, Himeji-Institute of Technology, 2000). Zur Analyse der Region oberhalb des 5-prime-Ende des murinen HRG-Gens wurde der pPAC4-Klon isoliert und subkloniert. Es wurde eine Sequenz von 1.889 Nukleotiden bestimmt. Die Sequenzierung des murinen HRG-Gens hat gezeigt, dass das Gen, genau wie sein humanes Pendant, aus sieben Exons und sechs Introns besteht. Wie bei den anderen Mitgliedern der Cystatin-Superfamilie werden die beiden N-terminalen Cystatin-ähnlichen Domänen von HRG, D1 und D2, jeweils von drei Exonen kodiert (Exon I bis III bzw. Exon IV bis VI). Die für HRG spezifische C-terminale Region des Moleküls wird dagegen nur durch ein einzelnes großes Exon (Exon VII) kodiert. Ein HRG-Knockout Vektor wurde konstruiert, indem ein 1.8-kb XBAI-BamHI Fragment durch eine Neomyzin-Kassette ausgetauscht wurde. Unter 144 Neomyzin-resistenten embryonale Stammzell-Klonen konnten 3 Klone identifiziert werden, in denen das 1.8-kb XBAI-BamHI -Fragment korrekt ausgetauscht worden war. Wir erzeugten Mäuse, bei denen der Translations-Beginn des ersten Exons des HRG-Gens funktionsunfähig ist. Das führt zu einer Null-Mutation des HRG-Gens (Hrg-/-). Homozygote HRG-Knockout Mäuse sind lebensfähig und fruchtbar, ihr Blut enthält jedoch kein HRG. Histologische Untersuchungen ihrer Organe weisen keine Unterschiede zwischen Wildtyp- und HRG-Knockout Mäusen auf. HRG bindet an Fibrinogen, Heparin und Plasminogen und wird somit als ein Regulator der Hämostase und Fibrinolyse betrachtet. In der Literatur sind drei Fälle von erblichem HRG Mangel in Zusammenhang mit einer familiären Thrombophilie beschrieben. Wir analysierten die Effekte von HRG auf die Koagulation und Fibrinolyse in Plasma von HRG-Knockout Mäusen und Wildtyp Mäusen. Messungen der Antithrombin-Aktivität im Plasmsa ergaben bei Anwesenheit gleicher Mengen Heparin höhere Werte für Hrg-/- Mäuse als für Hrg+/- und Hrg+/+ Mäuse. Die Prothrombin-Zeit war bei Hrg-/- Mäusen kürzer als bei Hrg+/- und Hrg+/+ Mäusen. Ebenfalls war die Blutungzeit nach Amputation der Schwanzspitze bei Hrg-/- Mäusen kürzer als bei Hrg+/+ Mäusen. Die fibrinolytische Aktivität in koaguliertem Blut war bei Hrg-/- Mäusen höher als bei Hrg+/+ Mäusen. Die Thrombozyten-Aggregation in Plättchen-reichem Plasma war nach Stimulation mit Thrombin, ADP oder Kollagen bei Hrg-/- Mäusen signifikant höher als bei Hrg+/+ Mäusen. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass HRG sowohl anti-koagulatorische als auch anti-fibrinolytische Eigenschaften besitzt und somit als Modulator der Hämostase und Fibrinolyse fungiert.Human histidine-rich glycoprotein (HRG) is a single-chain glycoprotein with a molecular weight of 67,000 composed of 507 amino acid residues. By it’s structural similarity, it is classified to belong to the cystatin superfamily like fetuin-A, fetuin-B and kininogen. Mature HRG circulates in blood at relatively high concentrations of up to 150 mg/l (~2 µM). HRG is exclusively synthesized in the liver, but it is stored in platelets and megakaryocytes where it can be released after thrombin stimulation. HRG may play a regulatory role in hemostasis and innate immunity. However, this role is uncertain for lack of rigorous testing in an animal model. To elucidate the in vivo function(s) of HRG, we cloned the mouse Hrg gene and generated HRG–deficient mice. As a first step, overlapping phage clones including mouse Hrg gene were isolated and subcloned. A complete nucleotide sequence of 13,591 bases was determined (Tsuchida, Master’s thesis, Himeji Institute of Technology, 2000). To analyze the 5-prime upstream region of the mouse Hrg gene, pPAC4 clone was isolated, subcloned and as a result of this a 1,889 nucleotides sequence was determined. The sequencing of the murine Hrg gene revealed that it consists of seven exons and six introns like its human counterpart. Like in other members of the cystatin superfamily, the cystatin-like domains D1 and D2 of HRG are encoded by three exons, exons I to III and IV to VI, respectively. The C-terminal HRG-specific portion of the molecule is encoded by one large exon VII. Next, the gene targeting vector was constructed by replacing a 1.8-kb XbaI-BamHI fragment containing exon I with a 1.8-kb neomycin cassette for positive selection of resistant clones. Three correctly targeted embryonic stem cell clones were identified among a total of 144 neomycin resistant clones. We generated mice lacking the translation start point of exon I of the Hrg gene, effectively resulting in a null mutation (Hrg-/-). Homozygous HRG-deficient mice were viable and fertile, but had no HRG in their blood. The histological analysis of organs revealed no gross differences between wild-type and HRG-deficient mice. Since it is known that HRG binds to fibrinogen, plasminogen and heparin, it is thought that HRG regulates blood coagulation and fibrinolysis. In addition, three cases of hereditary histidine-rich glycoprotein deficiency with familial thrombophilia have been reported. Therefore, we analyzed mainly effects of HRG on blood coagulation and fibrinolysis. Antithrombin activity in plasma of Hrg-/- mice was higher than in plasma of heterozygous Hrg+/- or wild-type Hrg+/+ mice in the presence of a fixed amount of heparin. The prothrombin time was shorter in Hrg-/- mice than in Hrg+/- and Hrg+/+ mice. Bleeding time after tail tip amputation in Hrg-/- mice was shorter than in Hrg+/+ mice. The spontaneous fibrinolytic activity in clotted blood of Hrg-/- mice was higher than in Hrg+/+ mice. The platelet aggregation activity of platelet rich plasma in the presence of thrombin, ADP and collagen in Hrg-/- mice was significantly higher than in Hrg+/+ mice. These findings suggest that HRG plays a role both as an anticoagulant and antifibrinolytic modifier. In addition it may function as an anti-platelet factor in vivo.
Fulltext: 
PDF
(additional files)
Dokumenttyp
Dissertation / PhD Thesis
Format
online, print
Sprache
English
Externe Identnummern
HBZ: HT014579001
Interne Identnummern
RWTH-CONV-114261
Datensatz-ID: 52018
Beteiligte Länder
Germany
|
The record appears in these collections: |