Charakterisierung des Gallensäuretransporters ASBT am Oozyten-Expressionssystem

Riehl, Stephan; Greven, Joachim

doi:1622

Charakterisierung des Gallensäuretransporters ASBT am Oozyten-Expressionssystem = Characterization of the taurocholate transporter ASBT in the oocyte expressionsystem

Riehl, Stephan (Author)

2006

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Stephan Riehl

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2006

Umfang100 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2006

Genehmigende Fakultät
Fak10

Hauptberichter/Gutachter
Greven, Joachim (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2006-09-21

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-16221
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/52116/files/Riehl_Stephan.pdf

Einrichtungen

Medizinische Fakultät (510000-1)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Medizin (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 610

Kurzfassung
In der vorliegenden Arbeit wurden Untersuchungen an dem Gallensäuretransporter ASBT (apical sodium bile acid transporter) durchgeführt. Der physiologischerweise in der apikalen Zellmembran von Cholangiozyten, Ileozyten und Zellen des proximalen Tubulus der Niere befindliche Transporter ist unter anderem essentiell für die Wiederaufnahme von Gallensäuren im Rahmen des enterohepatischen Kreislaufs. Die cRNA des ASBT wurde in Oozyten des Xenopus laevis injiziert und die erfolgreiche Expression des Gallensäuretransporters mittels Western Blot-Analyse verifiziert. Als Testsubstanz der Transportrate des ASBT diente Taurocholat, welches ein etabliertes Substrat des Gallensäuretransporters ist. Durch Vorversuche konnte gezeigt werden, dass die zwangsläufige Behandlung der Oozyten mit dem Mikroinjektor in Hinblick auf Aufnahmestudien unproblematisch ist, da keine gesteigerte Taurocholataufnahme in Puffer-injizierten Oozyten im Vergleich zu nativen, unbehandelten Oozyten bestand. Auch konnte im Rahmen der Vorversuche belegt werden, dass die Eizelle des afrikanischen Krallenfrosches über keinen endogenen Transportmechanismus zur Aufnahme von Taurocholat verfügt und der Taurocholattransport über den ASBT strikt an Natrium gekoppelt ist. Die Befunde zur bisher unklaren Stöchiometrie des Symportes von Taurocholat mit Natrium konnten nicht mit letzter Sicherheit aufgeklärt werden. Die erhobenen Werte sprachen am wahrscheinlichsten für ein Transportverhältnis von Natrium zu Taurocholat von zwei zu eins und widerlegten eindeutig die früheren Hypothesen eines elektroneutralen Transportes mit einer Stöchiometrie von Natrium zu Taurocholat von eins zu eins. Die zeitabhängige Taurocholataufnahme zeigte eine über drei Stunden nicht sättigbare und stetig zunehmende Taurocholatakkumulaton an der Oozyte. Untersuchungen zu der konzentrationsabhängigen Aufnahme von Taurocholat ergaben eine Sättigung der Transportrate des ASBT mit steigender Substratkonzentration. Mittels Transformation der Messwerte der konzentrationsabhängigen Taurocholataufnahme nach Eadie-Hofstee und mittels des Computerprogramms „Curffit“ konnten KM-Werte mit 32,02 µM und 41,84 µM, sowie Vmax-Werte von 139 pmol / Oozyt / 30min und 146,23 pmol / Oozyt / 30min für die beiden Lösungsmodelle bestimmt werden. Diese kinetischen Parameter, die erstmals an Oozyten erforscht wurden, deckten sich weitgehend mit den in der Literatur beschriebenen Angaben. Ebenfalls erstmalig an Oozyten des Xenpus laevis untersucht, konnte der hemmende Einfluss des Lösungsmittels DMSO auf die Transporteigenschaften das ASBT ab einer Konzentration von einem Prozent belegt werden. Mit S 0960, ein spezifischer Hemmstoff des ASBT, konnte in der höchsten Konzentration eine Reduzierung der Taurocholataufnahme um 60% erzielt werden. Die Regulation des ASBT durch die Proteinkinase A (PKA) wurde mit dem Aktivator der Adenylatcyklase Forskolin, dem Phosphodiesteraseinhibitor IBMX, dem cAMP-Analogon 8-bromo-cAMP und dem selektiven PKA-Inhibitor H 89 zum ersten Mal an Oozyten untersucht. Obwohl in der Literatur eindeutig belegt ist, dass der ASBT der Regulation der PKA unterliegt, stellte sich kein solcher Effekt in den Eizellen ein. Um die Regulation des ASBT durch die PKA weiter aufzuklären, sind also zukünftig zusätzliche Studien nötig, zumal zu diesem Thema bislang nur eine einzige Arbeit vorliegt. Dabei kann allerdings auf die Verwendung von Oozyten des Xenopus laevis nicht zurückgegriffen werden.

In the present study investigations on the bile acid transporter ASBT (apical bile acid transporter) have been conducted. This transporter physiologically occurs in the apical cell membrane of cholangiocytes, ileocytes and cells of the proximal tube of the kidney. It is among other essential for the re uptake of bile acids due to the course of enterohepatic circulation. The cRNA of the ASBT was injected in oocytes of Xenopus laevis and successful expression was verified by Wester-Blot analysis. As a well established substrate of the bile salt transporter taurocholic acid was chosen for the experiments. With the first experiments we were able to show that the treatment with the micro injector was no problem regarding the leaking of the oocytes’ membrane as there was no elevated taurocholic acid uptake of the buffer-injected oocytes compared to the untreated oocytes. Due to these first experiments we also were able to show that the oocyte of the African clawed frog doe not have any endogenous transport mechanisms for bile acid uptake and that the bile acid uptake of the micro injected oocytes is strictly depending on sodium. Highest correlation was obtained by assuming taurocholate to sodium ratio of one: two. This clearly opposes the previous theory of a electro neutral transport. Time dependence of taurocholate uptake into oocytes illustrated a constantly increasing uptake for three hours. Dependence of the taurocholate uptake on the taurocholate concentration showed a soluble transport ratio. Transformation of the data according to Eadie Hofstee revealed a KM= 32,02 µM and a Vmax= 139 pmol / oocyte / 30min and by the computer program “Curffit” a KM= 41,84 µM and a Vmax= 146,23 pmol / oocyte / 30min. These kinetic parameters were firstly obtained from experiments with oocytes and matched generally the data published in literature. Also firstly investigated was the inhibitory effect of DMSO on the taurocholic acid uptake of the ASBT. With a concentration of one percent the taurocholate uptake decreased significantly. The specific ASBT-inhibitor S 0960 decreased in it’s highest concentration the taurocholate uptake by 60%. Also for the first time in oocytes the regulation of the ASBT by the protein kinase A (PKA) has been studied with the activator of the adenylat cyclase Forskolin, the phosphodiesterase inhibitor IBMX, the cAMP-analogon 8-bromo-cAMP and the specific PKA-inhibitor H 89. Although in literature it is proven that the ASBT underlies the regulation of the PKA, we were not able to obtain this kind of data. To reveal the regulation of the ASBT by PKA there will have to be further investigation, since regarding this topic there only exists one paper so far. In order to do so one will have to use a different experimental method than the use of oocytes of Xenopus laevis.

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