Kryokonservierung von hepatischen Sternzellen der Ratte

Neyzen, Svenja; Weiskirchen, Ralf

doi:HT015283947

Kryokonservierung von hepatischen Sternzellen der Ratte = Cryopreservation of rat hepatic stellate cells

Neyzen, Svenja

2007

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Svenja Neyzen

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2007

Umfang104 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2007

Genehmigende Fakultät
Fak10

Hauptberichter/Gutachter
Weiskirchen, Ralf (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2007-07-18

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-19616
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/52371/files/Neyzen_Svenja.pdf

Einrichtungen

Lehrstuhl für Klinische Chemie und Pathobiochemie (526000-2)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Kryokonservierung (Genormte SW) ; Leberfibrose (Genormte SW) ; Apoptosis (Genormte SW) ; Immunoblot (Genormte SW) ; Medizin (frei) ; Hepatische Sternzellen (frei) ; p 53 (frei) ; CRP2 (frei) ; Elektronenmikroskopie (frei) ; DMSO (frei) ; hepatic stellate cells (frei) ; Oil-Red-O-Staining (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 610

Kurzfassung
In der vorliegenden Arbeit wurde ein Protokoll für die Kryokonservierung der HSC der Ratte entwickelt. Isolierte HSC der Ratte werden als Model der hepatischen Fibrogenese verwendet. An ihnen werden zahlreiche Vorgänge, wie die Biotransformation, die Genexpression, die Wirkung von Pharmazeutika, verschiedene Transkriptionsfaktoren und vieles mehr, studiert. Methoden für die Isolierung der HSC aus der Rattenleber und die weitere Zellkultivierung sind seit Jahren gut etabliert. Bis heute wird jedoch immer noch über den Ursprung der HSC, und das Vorhandensein verschiedener HSC-Subpopulationen spekuliert. Die klassische Theorie sieht das Septum transversum als Ursprungsort der hepatischen Sternzellen an, wohingegen eine neuere Theorie von einem neuroektodermalen Ursprung der HSC ausgeht.1 Zudem haben Untersuchungen gezeigt, dass aus der Rattenleber isolierte HSC zum Teil verschiedene Proteine, in unterschiedlichen Mengen (z. B. unterschiedliche Kollagene, alpha-sma) exprimieren.7 Aufgrund dieser Heterogenität der HSC wäre es interessant isolierte HSC zwischen den verschiedenen Laboren auszutauschen. Die Kryokonservierung der HSC und das anschließende Verschicken auf Trockeneis wären dafür eine praktikable Lösung. Daher wurde ein erfolgreiches Verfahren für die Langzeitkryokonservierung primärer, nicht aktivierter, HSC entwickelt. Es wurden zahlreiche Parameter, wie die Frierraten, die Vorbehandlung der HSC, die Kryoprotektiva, die Tauraten, die Zellzahl beim Kryokonservieren und die Lagerungsbedingungen, untersucht. Die Vitalität, die Zellmorphologie und die Zellcharakteristik der kryokonservierten HSC wurden durch zahlreiche Untersuchungen, mit denen unbehandelter HSC verglichen. Es wurden Licht- und Elektronenmikroskopische Analysen, Zellproliferationsassays, Apoptosetests, Färbungen und Westernblot-Analysen, der typischen Aktivierungsmarker, durchgeführt. Bei diesen Tests zeigten sich keine signifikanten Unterschiede, zwischen den unbehandelten und den kryokonservierten HSC. Weder die Zellmorphologie, noch ihre biochemischen und zellulären Eigenschaften werden, durch die Kryokonservierung, beeinträchtigt. Die Lagerung der kryokonservierten HSC zwischen 1-6 Monate zeigte, dass mit dem entwickelten Protokoll auch die Langzeitkryokonservierung der HSC möglich ist. Aufgrund dieser Ergebnisse kann gefolgert werden, dass kryokonservierte HSC in ihrer Funktionalität unbeeinträchtigt bleiben. Die Kryokonservierung stellt somit eine gute Möglichkeit für die Konservierung und den Austausch von HSC, zwischen verschiedenen Laboren, dar.

In this work a protocoll for the cryopreservation of rat hepatic stellate cells was developed. Isolated HSC of the rat are used as a model of liver fibrogenesis. Many proceedings are studied on this cells, for example the biotransformation, the gene expression, the effect of pharmaceuticals, different kinds of transcriptional factors and many more. Methods for the isolation of rat hepatic stellate cells and their cultivation are well established since years. Since today the discussion about the origin of HSC and different HSC subpopulations is not finished, and there is still room for speculations.The classical theory describes the septum trasnversum as origin of the hepatic stellate cells, in contrast a newer theory describes a neuroectodermal origin.1 In addition to this some examinations showed that isolated HSC are abel to express different kinds of proteins in different quantity (as example different kinds of collagene and alpha-smooth-muscle-actin).7 Because of this heterogeneity it could be very interesting to change isolated HSC between different laboratories. The cryopreservation and the exchange on dry ice could be a practical solution. Therefore a successful proceeding for the longtime storage of HSC was developed. Many parameters has been examined for example the freezing rates, the prefreeze processing the different cryoprotectants, the thawing conditions, the cell account by ml freezing solution and the storage conditions. The vitality, the cell morphology and the cell characteristic has been examined with untouched HSC by many different tests. Light and electronic microscopic analysis, cell proliferation assays, apoptosis testing, Oil Red O-staining, SDS-Page and immunoblotting of different marker proteins for fibrogenesis has been passed through. These examinations showed no significant differences between the cryopreserved and untouched cells. Neither the cell morphology nor the biochemical and cellular qualities are impaired by the cryopreservation process. The storage of cryopreserved HSC showed that a longtime storage of HSC between one till six months is possible with the devoleped protocol. These results showed us that cryopreserved HSC are untouched in their functionality. Consequently the cryopreservation is a practical possibility for the conservation and the exchange of HSC between laboratories.

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