Nachweis von parodontopathogenen Bakterien mit Hilfe von Genchips

Schulthoff, Wiebke; Conrads, Georg

doi:1863

Nachweis von parodontopathogenen Bakterien mit Hilfe von Genchips = Detection of periodontal pathogens by Genechips

Schulthoff, Wiebke (Author)

2007

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Wiebke Schulthoff

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2007

UmfangIII, 88 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2007

Genehmigende Fakultät
Fak10

Hauptberichter/Gutachter
Conrads, Georg (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2007-03-01

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-18635
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/52675/files/Schulthoff_Wiebke.pdf

Einrichtungen

Lehr- und Forschungsgebiet Orale Mikrobiologie und Immunologie (541000-3)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Parodontitis (Genormte SW) ; Polymerase-Kettenreaktion (Genormte SW) ; Hybridisierung <Biologie> (Genormte SW) ; Medizin (frei) ; Genchip (frei) ; Parocheck (frei) ; Nachweisverfahren (frei) ; periodontits (frei) ; polymerase chain reaction (frei) ; genechip (frei) ; parocheck (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 610

Kurzfassung
Kern dieser Arbeit ist der Nachweis parodontopathogener Keime mit Hilfe von Genchips. Der Versuchsreihe lag das ParoCheck® Kit 20 zugrunde. ParoCheck® ist der erste kommerzielle DNA-Chip zum semiquantitativen Nachweis von Parodontitis assoziierten Keimen. Mit dem Kit 20 lassen sich folgende Keime nachweisen: Actinobacillus actinomycetem comitans A.a., Actinomyces odontolyticus A.o., Bacteroides forsythus B.f. (synonym: Tannerella forsythensis, T.f.), Campylobacter concisus C.c, Campylobacter gracilis C.g., Campylobacter rectus C.r., Capnocytophaga gingivalis Cap.g., Eikenella corrodens E.c., Eubacterium nodatum E.n., Fusobacterium nucleatum F.n., Peptostreptococcus micros P.m., Porphyromonas gingivalis P.g., Prevotella intermedia P.i., Prevotella nigrescens P.n., Streptococcus constellatus S.c., Streptococcus gordonii S.g., Streptococcus mitis S.m., Treponema denticola T.d., Veillonella parvula V.p.. Es wurden 10 Proben von verschiedenen Patienten mit chronischer Parodontitis entnommen. Der Untersuchung wurde eine ausführliche Anamnese und Befunderhebung sowie ein Parodontalstatus zugrunde gelegt. Nach Probeentnahme wurde im Labor die DNA extrahiert, mittels PCR amplifiziert und schließlich auf dem Chip hybridisiert. Jede Probe wurde sowohl mit der Hilfe des vom Entwicklungsstandard her älteren ParoCheck® Chips (ParoChip1) analysiert, als auch mit der des neuen, moderneren Chips (ParoChip2). Die beiden Chips unterscheiden sich im Aufbau: Der ParoChip1 ist ein Glasobjektträger, der nur eine einzige Patientenprobe aufnehmen kann und für jedes Bakterium drei Messpunkte aufweist. Im Gegensatz dazu handelt es sich bei dem ParoChip2 um einen Plexiglasobjektträger, der 12 Patientenproben aufnehmen kann und für jedes Bakterium fünf Messpunkte vorsieht. Für beide Chips wurden Fluorophor markierte Primer für die PCR (Cy5 markiert) und Fluorophor markierte Sonden für interne Kontrollsysteme (Cy3 markiert) verwendet. Sie wurden mit dem Axon Scanner 4100A bei den Wellenlängen 532nm (Cy3 markiert) und 635nm (Cy5 markiert) gescannt und anhand der zugehörigen Software (GenePix4.x) analysiert. Die Ergebnisse der beiden Chips stimmten in 75% der Fälle überein. Die Diskrepanzen sind wahrscheinlich auf die unterschiedliche Oberflächenchemie der Chips und die daraus resultierenden verschiedenen Signal-to-Noice-Ratio (SNR)-Schwellenwerte zurückzuführen. Im Einzelfall liegt aber auch eine veränderte (spezifitätsverbesserte) Sondensquenz den Diskrepanzen zugrunde. Im Vergleich mit bisherigen Nachweisverfahren konnten klare Vorteile wie die Detektion von bis zu 20 Bakterienarten in einem einzigen Hybridisierungsverfahren, die schnelle Vorlage der Ergebnisse und der robuste wie semiquantitative Charakter des Testverfahrens herausgestellt werden. Sensitivität, Spezifität und Praktikabilität des Testverfahrens müssen noch in weiteren mikrobiologischen wie klinischen Studien ermittelt werden, damit ParoCheck® Genchips etabliert werden und einen festen Platz in der Routinediagnostik einnehmen können.

The focus of this dissertation is the detection of periodontal pathogens by Genechips. The experiments were done with the ParoCheck® Kit 20. It is the first commercial, semi-quantitative DNA-Chip for the detection of periodontitis associated bacteria. The following bacteria can be detected by the ParoCheck® Kit 20: Actinobacillus actinomycetem comitans A.a., Actinomyces odontolyticus A.o., Bacteroides forsythus B.f. (synonym: Tannerella forsythensis, T.f.), Campylobacter concisus C.c, Campylobacter gracilis C.g., Campylobacter rectus C.r., Capnocytophaga gingivalis Cap.g., Eikenella corrodens E.c., Eubacterium nodatum E.n., Fusobacterium nucleatum F.n., Peptostreptococcus micros P.m., Porphyromonas gingivalis P.g., Prevotella intermedia P.i., Prevotella nigrescens P.n., Streptococcus constellatus S.c., Streptococcus gordonii S.g., Streptococcus mitis S.m., Treponema denticola T.d., Veillonella parvula V.p.. Ten samples from ten different patients with a chronic periodontitis were taken. Each patient was examined for a detailed anamnesis and a periodontal status. After taking the samples the DNA was extracted, amplified by PCR and finally hybridised on the Chips. Each sample was analysed with the older ParoChip® (ParoChip1) and also with the more modern version of the Chip (ParoChip2). Both Chips have a different configuration. ParoChip1 is a glass microscope slide which can hold only one single sample. For each bacteria there are three measuring points on the Chip. In contrast, the ParoChip2 is a plexiglass microscope slide which can hold 12 samples and has five measuring points for each bacteria. Both Chips used fluorophor marked primer for the PCR (cy5 marked) and fluorophor marked probes for internal control systems (cy3 marked). The Chips were scanned with the wavelength 532nm (cy3 marked) and 635nm (cy5 marked) by the Axon Scanner 4100A and analysed by the GenePix4.x software. The results of both Chips matched in 75% of the tests. The discrepancy between the Chips is likely due to the different surface chemistry and therefore the different SNR- (Signal-to-Noise-Ratio) thresholds. In single cases a different probesequence (with better specificity) may also be an explanation. In comparison with other methods of bacteria detection the GeneChip had clear advantages: The detection of 20 bacteria in one test, quick results and also the robust and semi-quantitative character. Additional microbiological and clinical studies are required, particularly for specificity, sensitivity and practicality of the method, however initial testing suggest that the ParoChip® Genechips could find a place in routine diagnostics.

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