Implication of Bcl-2 family members in apoptosis signalling pathways triggered by growth factor deprivation

Fleischer, Aarne; Rebollo, Angelita

doi:510

Implication of Bcl-2 family members in apoptosis signalling pathways triggered by growth factor deprivation

Fleischer, Aarne

2003

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Aarne Fleischer

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2003

UmfangII, 135 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2003

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Rebollo, Angelita (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2003-02-26

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-5106
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/56298/files/Fleischer_Aarne.pdf

Einrichtungen

Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften (100000)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Biowissenschaften, Biologie (frei) ; apoptosis (frei) ; Bcl-2 family (frei) ; mitochondria (frei) ; caspases (frei) ; interleukin (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Apoptose, der programmierte Zelltod, ist ein zelluläres Suizidprogramm, das selektiv überschüssige oder potentiell gefährliche Zellen eliminiert. Zur Aufklärung der Signaltransduktionswege, die den Ablauf von Apoptose und Proliferation kontrollieren, wurde der Entzug von Zytokinen als physiologischer, apoptotischer Stimulus genommen. In der vorliegenden Arbeit wurde mit Hilfe der Representational Difference Analysis die kurze Spleissvariante des Integral Membrane Proteins (ITM2Bs) als eine neue Zelltodkomponente identifiziert, die nach IL-2-Entzug sowohl auf Transkriptions- als auch Translationsebene hochreguliert wurde. Es wurde gezeigt, dass ITM2Bs zur BH3-Gruppe der Bcl-2-Proteinfamilie gehört und Apoptose auslöst, indem es die anti-apoptotische Funktion des Bcl-2 Proteins neutralisiert. Biochemische und konfokal-mikroskopische Untersuchungen ergaben, dass die Binding von ITM2Bs an Mitochondrien mit einem Verlust des mitochondrialen Membranpotentials, mit der Freisetzung von Cytochrome c in das Zytosol als auch mit der Aktivierung von Initiator- und Effektor-Caspasen korrelierte, was einen Mitochondrien-vermittelten Signalweg vermuten lässt. Funktionelle Protein-Interaktionen spielen eine fundamentale Rolle in der Signaltranduktion. In dieser Studie wurde eine neue Schlüsselfunktion für den lymphspezifischen Transkriptionsfaktor Aiolos beschrieben, der in apoptotischen T-Lymphozyten als Bindungspartner für das anti-apoptotische Bcl-xL Protein nachgewiesen wurde. Der Phosphorylierungsstatus schien von grosser Bedeutung zu sein, da die Dephosphorylierung von Aiolos und Bcl-xL nach IL-4-Entzug zur erhöhten Bindung zwischen beiden Proteinen führte. Diese Ergebnisse deuten auf ein Modell hin, in dem die anti-apoptotischen Effekte des Bcl-xL Proteins durch die Bindung an dephosphorylierten Aiolos gehemmt werden. Ausserdem konnten die anti-apoptotischen Proteine, Bcl-xL und Bcl-w, als 'targeting subunits' der Serin/Threonin-Phosphatase PP1alpha in IL-4-stimulierten T-Lymphozyten sowie in frisch-isolierten Thymozyten nachgewiesen werden. Durch Coimmunopräzipitationen wurde gezeigt, dass Bcl-xL als auch Bcl-w mit PP1alpha und Bad interagieren konnten, wobei zwei verschiedene trimolekulare Komplexe gebildet wurden, Bcl-xL/PP1alpha/Bad und Bcl-w/PP1alpha/Bad. Die Entfernung von Bcl-xL/Bcl-w durch eine Serie von Immunopräzipitationen führte zu einer Verminderung der Interaktion zwischen PP1alpha und ihrem Substrat Bad, so dass die Dephosphorylierung von Bad und der anschliessende programmierte Zelltod verhinderte wurde. Weiterhin wurde die pro-apoptotische Funktion von Bad durch subzelluläre Lokalisation reguliert. Es wurde gezeigt, dass ein Grossteil von Bad nach IL-4-Zugabe in Rafts lokalisiert war. Dabei wies Bad keine Phosphorylierungen auf, konnte aber keine Zelltod-induzierende Funktion ausüben, da Bad in den Plasmamembran-Mikrodomänen festgehalten wurde. Durch konfokal-mikroskopische Untersuchungen wurde nachgewiesen, dass der Entzug von IL-4 eine Umstrukturierung der Lipid Rafts auslöste. Dadurch konnte Bad von der Plasmamembran segregieren und zu Mitochondrien wandern, was mit dem Zelltod von T-Lymphozyten korrelierte.

Apoptosis or programmed cell death is a conserved cellular suicide program that selectively eliminates excess or potentially dangerous cells. To elucidate the signalling pathways implicated in the regulation of apoptosis and proliferation, cytokine withdrawal was used as a physiological stimulus to trigger programmed cell death. By means of representational difference analysis, the short isoform of the integral membrane protein (ITM2Bs) was identified in the present study as a novel regulator of cell death that was upregulated upon IL-2 deprivation. ITM2Bs was shown to belong to the BH3-only members of the Bcl-2 family and promoted apoptosis by antagonizing the pro-survival function of Bcl-2 protein. Biochemical and confocal studies demonstrated that association of ITM2Bs to mitochondria correlated with loss of mitochondrial membrane potential, release of cytochrome c into the cytosol as well as activation of up- and downstream caspases suggesting signalling via mi! tochondrial-mediated pathways. Functional interactions between proteins play a pivotal role in signal transduction. In this work, a novel function has been uncovered for the lymphoid-specific transcription factor Aiolos that was found to be associated with the pro-survival Bcl-xL protein in IL-4-deprived, but not IL-4-stimulated T-lymphocytes. The phosphorylation status appeared to be important since dephosphorylation of Aiolos and Bcl-xL increased their binding affinity following IL-4 withdrawal. These data propose a model, in which the anti-apoptotic effects of Bcl-xL are blocked through its sequestration by unphosphorylated Aiolos. Moreover, the anti-apoptotic proteins Bcl-xL and Bcl-w were identified as targeting subunits of the serine/threonine phosphatase PP1alpha in IL-4-stimulated T-lymphocytes as well as in freshly isolated thymocytes, replacing Bcl-2 as regulatory subunit of PP1alpha in IL-2-stimulated cells. Using co-immunoprecipitation assays, Bcl-xL or Bcl-w were shown to interact with PP1alpha and Bad forming two types of trimolecular complexes, Bcl-xL/PP1alpha/Bad and Bcl-w/PP1alpha/Bad. Depletion of Bcl-xL and Bcl-w resulted in loss of the interaction of PP1alpha and its substrate Bad, thus preventing dephosphorylation of Bad and subsequently programmed cell death. In addition to phosphorylation, the function of the pro-apoptotic Bad is also regulated by subcellular localization. It was demonstrated that a major fraction of Bad was localized in rafts upon IL-4 stimulation. This pool of Bad was dephosphorylated, but it was unable to exert its cell death-inducing function due to its sequestration in these plasma membrane microdomains. Confocal microscopy studies provided evidence that IL-4 deprivation triggered disorganization of lipids rafts, resulting in the segregation of dephosphorylated Bad from the plasma membrane and subsequent translocation to mitochondria correlating with T-lymphocyte death.

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