Regulation of keratin filament network dynamics

Moch, Marcin; Leube, Rudolf E.; Pradel, Gabriele

doi:urn:nbn:de:hbz:82-rwth-2015-075019

Regulation of keratin filament network dynamics = Steuerung der Keratinfilament-Netzwerk-Dynamik

Moch, Marcin

2016

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Marcin Moch

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2016

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2015

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University 2016

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Leube, Rudolf E. (Thesis advisor) ; Pradel, Gabriele (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2015-06-19

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-rwth-2015-075019
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/564820/files/564820.pdf
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/564820/files/564820.pdf?subformat=pdfa

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Biowissenschaften, Biologie (frei) ; Keratin (frei) ; Actin (frei) ; Microtubules (frei) ; EGF (frei) ; EGFR (frei) ; Hemidesmosomes (frei) ; Plectin (frei) ; FAK (frei) ; Src (frei) ; Integrin (frei) ; Focal adhesions (frei) ; A431 (frei) ; HaCaT (frei) ; Laminin-332 (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Intermediärfilamente, Aktinfilamente und Mikrotubuli sind die Hauptkomponenten des Zytoskeletts mehrzelliger Organismen. In Epithelien und davon abstammenden Krebszellen bestehen die Intermediärfilamente aus Typ I und Typ II Keratin-Polypeptiden. Das Keratinnetzwerk ist sowohl an Desmosomen, die Zellen untereinander verbinden, als auch an Hemidesmosomen, die die Verbindung zwischen Zellen und der extrazellulären Matrix vermitteln, verankert. Das Keratinzytoskelett dient dem Schutz der Zellen gegen verschiedene Formen von Stress, und ist zudem an fundamentalen Zellprozessen beteiligt, wie Signalweiterleitung, Differenzierung und der Verteilung von Organellen. Zeitrafferaufnahmen von Epithelzellen, die fluoreszent markierte Keratine exprimieren, zeigen, dass das Keratinnetzwerk fortlaufend in Bewegung ist. Basierend auf diesen Beobachtungen wurde ein komplexer Zyklus des Keratinumsatzes definiert. Dementsprechend findet die Nukleation von Keratinpartikeln in der Zellperipherie nahe fokaler Adhäsionskontakte statt, gefolgt von der Elongation zu Keratinfilamenten und ihrer Integration in das bestehende periphere Keratinnetzwerk mit einer anschließenden Bündelung. Dabei werden die Keratinfilamente Aktin- und Mikrotubuli- abhängig in das Innere der Zelle transportiert. Die Filamente können letztendlich entweder zu stabilen Filamenten, die den Nukleus käfigartig umschließen, reifen oder sie können alternativ in einzelne lösliche Untereinheiten zerfallen und für die Bildung von neuen Filamenten in der Zellperipherie verwendet werden. Das Ziel der vorgelegten Arbeit war die Entwicklung von Werkzeugen und Bedingungen, die die Quantifizierung des beschriebenen Keratinzyklus ermöglichen und darauf aufbauend Regulatoren der Keratindynamik zu identifizieren. Die Experimente wurden in unterschiedlichen epithelialen Zelllinien durchgeführt, die fluoreszent markierte Keratine, teilweise in Kombination mit weiteren vielversprechenden fluoreszent markierten Proteinen beziehungsweise shRNA, exprimieren. Unter hoch standardisierten Bedingungen wurden Zeitrafferaufnahmen aufgenommen, um die Geschwindigkeit, die Transportmenge, und den Verzweigungsgrad innerhalb des Keratinnetzwerks zu bestimmen. Dazu wurden neue Werkzeuge verwendet, die in einer Kooperation mit dem Lehrstuhl für Bildverarbeitung der RWTH Aachen entwickelt wurden. Die Ergebnisse wurden mit konventionellen Methoden, wie fluorescence recovery after photobleaching und manueller Nachverfolgung, verglichen und validiert. Ferner wurden die Ergebnisse ergänzt durch Immunoblot- und Immunozytochemie-Analysen.Mithilfe der neuen Werkzeuge wurden die Bewegung und der Durchsatz von Keratinfilamenten mit subzellulärer Auflösung quantifiziert. Die Ergebnisse unterstützen weitgehend den vorgeschlagenen Keratinzyklus. Sie zeigen deutlich und objektiv, dass die Bildung von Keratinfilamenten überwiegend in der Zellperipherie, sowie in den Retraktionsfortsätzen migrierender Zellen, stattfindet. Der Abbau von Keratinfilamenten wiederum findet hauptsächlich in den zentralen Regionen der Zelle um den Zellkern statt. Es konnte zudem gezeigt werden, dass sich die Bewegung und der Umsatz von Keratinfilamenten mit steigernder Zeit nach der Ausplattierung der Zellen reduzieren. Diese Verlangsamung wird deutlicher, wenn Zellen unter Konditionen kultiviert werden, die die Bildung von hemidesmosomalen Strukturen begünstigen. In Übereinstimmung damit, führt die Verringerung der Expression von Plectin, das als Zytolinker für die Verknüpfung von Keratinen an Hemidesmosomen verantwortlich ist, zu einem geringeren Verzweigungsgrad des Keratinnetzwerks und somit zu einer gestörten Organisation, ohne jedoch den Keratinumsatz zu beeinflussen. Weitere Ergebnisse zeigen, dass der sessile Phänotyp von Zellen durch den epidermalen Wachstumsfaktor EGF umgekehrt wird. Die Zugabe von EGF führt zu einer Steigerung der Bildung und Bewegung sowie des Abbaus von Keratinfilamenten. Unerwarteterweise führte die Inaktivierung der fokalen Adhäsionskinase FAK nicht zu Änderungen der Keratinfilamentdynamik. Stattdessen konnte die Tyrosinkinase Src als möglicher Modulator der Keratindynamik identifiziert.Diese Arbeit zeigt erstmals, dass die Keratinfilamentdynamik durch spezifische Kulturbedingungen und durch Signalwege reguliert wird. Die Identifizierung von EGF als einen positiven Modulator des Keratinfilamentumsatzes und die neu entwickelten Werkzeuge werden die Suche nach molekularen Mechanismen downstream des EGFR, die beim Auf- und Abbau von Keratinfilamenten relevant sind, erleichtern.

Intermediate filaments are together with actin filaments and microtubules major components of the metazoan cytoskeleton. In epithelial and epithelium-derived cancer cells intermediate filaments are composed of type I and type II keratin polypeptides. The keratin network is anchored to desmosomes, which connect cells to each other, and to hemidesmosomes, which attach epithelial cells to the extracellular matrix. The keratin cytoskeleton protects cells against various types of stress and is involved in fundamental cellular processes including signalling, differentiation and organelle trafficking. Time-lapse fluorescence microscopy of cultured epithelial cells producing fluorescently-tagged keratins has shown that the keratin network is in continuous motion and undergoes cycles of assembly and disassembly. From these data a complex cycle of keratin turnover was proposed consisting of peripheral nucleation of keratin particles next to focal adhesions, followed by elongation of these particles and their integration into the peripheral network with subsequent bundling of keratin filaments. The assembling keratins are transported to the cell interior in an actin filament- and microtubule-dependent fashion. Perinuclear filaments either mature into a stable perinuclear cage or disassemble into soluble subunits that rapidly diffuse and are re-utilised for another round of assembly in the cell periphery. The aim of this work was to develop tools and conditions to measure the keratin cycle in order to identify regulators of keratin dynamics. Experiments were performed in different epithelial cell lines producing fluorescently-tagged keratins alone and in combination with other fluorescent proteins of interest and specific shRNAs. Motion, bulk flow, and branching of keratins were calculated from time lapse recordings in different cell lines under defined and highly standardised conditions using novel tools that were developed in cooperation with the “Institute of Imaging & Computer Vision” of RWTH Aachen University. The results were compared to and validated by conventional methods such as fluorescence recovery after photobleaching and manual tracking. The results were complemented by immunoblot analyses and immunocytochemistry. Using these tools motion and turnover of keratins was quantified at subcellular resolution providing strong support for the proposed keratin cycle. The analyses presented overwhelming and objective evidence that keratin assembly takes place primarily in the cell periphery occurring even in the highly elongated retraction fibres of migrating cells and that disassembly occurs predominantly in the central, perinuclear part of the cells. I could show that keratin motion and turnover decreased with increasing times after plating. The decrease was further enhanced when cells were cultivated under conditions favouring the formation of hemidesmosomal structures. In accordance, downregulation of the cytoskeletal cross linker plectin, which is involved in hemidesmosomal anchorage of keratins, perturbed keratin network organisation through disruption of hemidesmosomal attachment, but did not otherwise affect keratin dynamics and led only to a slight but significant decrease in keratin network branching. On the other hand, epidermal growth factor (EGF) reversed the sessile phenotype of epithelial cells increasing keratin filament formation, keratin filament movement, and keratin filament disassembly. Unexpectedly, inactivation of focal adhesion kinase had no short term influence on keratin dynamics. Instead, Src was identified as a possible candidate for regulation of keratin dynamics. This work shows for the first time that keratin dynamics are regulated by specific culture conditions and signalling pathways. The identification of EGF as a positive modulator of keratin turnover and the newly developed tools simplify the search for molecular mechanisms that are involved in keratin assembly and disassembly downstream of the EGFR.

OpenAccess:
PDF PDF (PDFA)
(additional files)