Protein engineering for polyethylene terephthalate degradation

Lülsdorf, Nina; Schwaneberg, Ulrich; Elling, Lothar

doi:urn:nbn:de:hbz:82-rwth-2016-008245

Protein engineering for polyethylene terephthalate degradation = Protein-Engineering für den Abbau von Polyethylenterephthalat

Lülsdorf, Nina

2016

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Master of Science (M.Sc.) Biologie Nina Lülsdorf aus Troisdorf

ImpressumAachen 2016

Umfang1 Online-Ressource (ix, 90 Blatt) : Illustrationen

Dissertation, RWTH Aachen, 2016

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Schwaneberg, Ulrich (Thesis advisor) ; Elling, Lothar (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2016-01-26

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-rwth-2016-008245
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/567568/files/567568.pdf
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/567568/files/567568.pdf?subformat=pdfa

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Biowissenschaften, Biologie (frei) ; directed evolution (frei) ; polyethylene terephthalate (frei) ; esterase (frei) ; gelenkte Evolution (frei) ; Polyethylenterephtalat (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Heutzutage ist Plastik eines der wichtigsten Materialen im täglichen Leben, und findet Gebrauch in unzähligen Anwendungen (z.B. Verpackung, Auto oder Möbel). Innerhalb des Plastiks ist Polyethylenterephthalat (PET) das weltweit meist genutzte Polymer. In 2014 wurden weltweit rund 40 Mio. Tonnen PET für die Produktion von Plastikflaschen, synthetischen Fasern und Folien verwendet. Um den Anforderungen des modernen Lebens zu entsprechen, sind die meisten Sporttextilien aus hydrophoben PET Polymer hergestellt, wodurch die Textilien wasserabweisend werden. Durch die zusätzliche Verlinkung mit Silber können diesen auch antimikrobielle Eigenschaften zugeordnet werden. Durch die Reinigung von synthetischen Textilien kommt es zu einer Anreicherung von mikroplastischem PET im Grundwassersystem. Darüber hinaus kann auch eine Anreicherung in terrestrischen und marinen Umgebungen nachgewiesen werden, da PET nur eine geringe biologische Abbaubarkeit zugeordnet werden kann Der chemische oder mechanische Abbau von PET wird unter extremen Bedingungen durchgeführt (hoher Druck, Säure-, Basegehalt). Diese Abbau-Methode ist darüber hinaus sehr zeitintensiv und erzielt dabei nur einen unvollständigen PET Abbau. Der enzymatische Abbau von PET hat ein vielversprechendes Anwendungspotential, da PET in seine Monomere zerteilt wird. Damit stellt der enzymatische Abbau eine umweltfreundliche Methode dar, um akkumulierte Plastikpartikel zu entfernen. Das Prinzip und die molekulare Basis der PET Hydrolyse ist bis zum heutigen Zeitpunkt noch nicht aufgeklärt. In vorangegangen Studien konnte gezeigt werden, dass Hydrolasen (z.B. Esterasen und Cutinasen) das Potential besitzen den PET Abbau zu katalysieren, allerdings mit geringer Aktivität. Für eine Anwendung im biologischen Abbauprozess (z.B. Abwasserbehandlung oder Waschmittel) müssen die Enzyme hinsichtlich ihrer Aktivität gegenüber PET und ihrer Resistenz bei hohen Temperaturen optimiert werden. Seit den 70er Jahren wird die Enzymoptimierung auf Basis der gelenkten Evolution oder des rationalen Designs durchgeführt. Der kritischste Punkt in jedem gelenkten Evolutionsexperiment ist die Entwicklung eines Durchmusterungssystems, welches die Anforderungsbedingungen bestmöglich abbildet. Für das Mikrotiterplatten (MTP)-basierte Durchmusterungssystem wurde Phenylbenzoat, ein komplexes aromatisches Modelsubstrat, verwendet. Das Durchmusterungssystem basiert auf der indirekten Feststellung der esterolytischen Aktivität durch die Detektion von Phenolen mittels 1,5 dimethyl-1-4-(4-oxo-cyclohexa-2,5-dienylidenamino)-2 phenyl-1,2-dihydropyrazol-3-one. Die Bildung des Produkts wird kontinuierlich über den Anstieg der Absorption bei 509 nm ermittelt. Das neuartige Durchmusterungssystem wurde mittels einer fehlerhaften Polymerase-Kettenreaktion Esterase-Mutantenbibliothek validiert, welche auf verbesserte Enzymaktivität bei erhöhter Temperatur durchmustert wurde. Die dabei identifizierte Variante T3 (Ser378Pro) wurde charakterisiert und zeigt eine 4,7-fache Verbesserung bezüglich der thermischen Resistenz. MTP-Durchmusterungssysteme haben einen Durchsatz von 10^4-10^5 Varianten, welches nicht ausreichend ist, um den Sequenzraum von Gen Diversitätsbibliotheken (108-109) zu erfassen. Um den Durchsatz zu erhöhen und den kompletten Sequenzraum zu erfassen wurde ein neues ultra-hoch Durchsatz-Durchmusterungssystem als Teil eines universellen Werkzeugkastens für Hydrolasen optimiert. Das Durchmusterungssystem basiert auf einer enzymatisch gekoppelten Reaktion mit Glukosederivaten als Substrat. Das final gebildete fluoreszierende Hydrogel lagert sich um die E. coli Zellen an. Die entwickelte Durchmusterungsplattform wurde für eine fehlerhafte Polymerase-Kettenreaktion Esterase-Mutantenbibliothek verwendet und führte zu der Identifizierung der Variante E1 (Glu256Gly, Gly401Val) mit einem 7,1-fach höheren kcat und einem 2-fach reduziertem KM. Um die Struktur-Funktions-Beziehung der Esterase hinsichtlich des PET-Abbaus zu verstehen, wurden Untersuchungen an einem 18 Aminosäuren langen deckelähnlichen Loop vorgenommen. Der Loop bedeckt das aktive Zentrum und wurde hinsichtlich verschiedener Längen (16-0 Aminosäuren) modifiziert und die Aktivität gegenüber PET ermittelt. Es wurde eine Korrelation zwischen Abnahme der Aktivität bei Abnahme der Looplänge festgestellt. Bei einer kompletten Entfernung des Loops ist die Esterasevariante inaktiv. Dies bestätigt, dass der deckelähnliche Loop eine Schlüsselrolle für die Esteraseaktivität spielt.

Plastics play an important part in nowadays life since it became the material of choice used in countless application (e.g. packaging, automobiles or furniture). Among all plastics, polyethylene terephthalate (PET) is globally one of the most abundant and in 2014 approximately 40 million tons of PET were used for the production of plastic bottles, synthetic fibers, and foils. In order to meet requirements of modern life style, most of the commonly sport clothing are made of highly hydrophobic PET polymer making the clothes waterproofed and antimicrobial if linked to silver. Washing of synthetic clothes causes microplastic PET accumulation into freshwater systems through household sewage discharge. Additionally, low PET biodegradability causes its accumulation in terrestrial and aqueous environment in form of either by products during PET production or accumulated PET after final usage. Chemical or mechanical PET degradation is usually performed under harsh conditions (high acidic, high basic, high pressure) in a time consuming manner resulting in incomplete PET degradation. Alternatively, enzyme based PET degradation showed to have an application potential to completely degrade PET into monomers and offers environmentally friendly method for removal of accumulated plastic particles. Up to date no successful enzyme based PET degradation was achieved since principle and underlying molecular basis of hydrolysis of PET is still not elucidated. In previous studies it was shown that potential enzymes with an ability to catalyse PET degradation are hydrolases (i.e. esterases and cutinases) with still weak activities towards PET. In order to be applied in biodegradation processes (e.g. waste water treatment, laundry detergents) the enzyme candidates need to be further optimized regarding its specific activity towards PET, and resistance towards high temperatures. The enzyme optimization was since 1970s done using directed evolution and rational design. A main bottleneck of every directed evolution experiment is the design of a screening system which mimics application conditions as close as possible. In order to evolve hydrolases having high specific activity towards PET the complex aromatic model substrate, phenol benzoate was used to develop and optimize microtiter plate (MTP) based screening system. The screening system is based on indirect monitoring of esterolytic activity through detection of phenols with 1,5-dimethyl-1-4-(4-oxo-cyclohexa-2,5-dienylidenamino)-2 phenyl-1,2-dihydropyrazol-3-one. The product formation is followed continuously as an increase of absorbance at 509 nm. Validation of novel screening system was done by screening error-prone PCR (epPCR) esterase mutant library for improved esterase activity at elevated temperature. The identified esterase variant T3 (Ser378Pro) showed a 4.7 fold improved residual activity after thermal treatment. MTP screening formats offer screening throughput of 10^4-10^5 variants which is insufficient to cover sequence space in generated gene diversity library (10^8-10^9). In order to increase screening throughput and increase coverage of sequence space a novel ultra-high throughput screening system was optimized as a part of a universal screening toolbox for hydrolases. The screening is based on coupled enzyme reaction using glucose derivatives as substrates which upon hydrolysis forms a fluorescent hydrogel layer on the surface of the E. coli cells. Applying a developed screening platform on epPCR esterase library resulted in a variant E1 (Glu256Gly, Gly401Val) with a 7.1-fold higher kcat and 2-fold reduced KM. Additionally, in order to generate first hypothesis on PET degradation mechanism, an in depth analysis of esterase lid like loop (18 amino acids) in close proximity of the active site was done. Shortening and complete deletion of the esterase loop was performed and its influence on PET degradation activity was followed. The activity decrease correlates with the decrease in loop length and revealed in an inactive esterase variant in case the complete lid like loop was deleted. This confirmed that the lid like loop has a key importance for the esterase activity.

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