Klonierung und funktionelle Charakterisierung des 'long transient receptor channel 2', LTRPC2, einem Mitglied der Familie kalziumpermeabler TRP-Kationenkanäle

Wehage, Edith Maria; Lückhoff, Andreas

doi:urn:nbn:de:hbz:82-opus-5000

Klonierung und funktionelle Charakterisierung des 'long transient receptor channel 2', LTRPC2, einem Mitglied der Familie kalziumpermeabler TRP-Kationenkanäle

Wehage, Edith Maria (Author)

2003

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Edith Maria Wehage

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2003

UmfangVIII, 136 S. : graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2003

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Lückhoff, Andreas (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2003-01-31

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-5000
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/57219/files/03_030.pdf

Einrichtungen

Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften (100000)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Biowissenschaften, Biologie (frei) ; LTRPC2 (frei) ; TRP-Kanäle (frei) ; Ca2+ (frei) ; Spleißvarianten (frei) ; neutrophile Granulozyten (frei) ; H2O2 (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
TRP-Kanäle werden mit einem ligandengesteuerten Ca^(2+)-Influx in elektrisch nicht erregbaren Zellen in Verbindung gebracht. Bei der Frage zur physiologischen Relevanz der TRP-Kanäle wurde als Modell für elektrisch nicht erregbare Zellen der neutrophile Granulozyt gewählt. Die Aktivierung Neutrophiler ist von einer Depolarisation und einem Anstieg der [Ca^(2+)]i begleitet, bis heute ist jedoch die Identität der Proteine nicht geklärt, die an dem Aktivierungsgeschehen beteiligt sind. Von verschiedenen TRP-Kanälen exprimieren neutrophile Granulozyten den Kanal LTRPC2 besonders stark. Um die Bedeutung des LTRPC2 für Aktivierung von neutrophilen Granulozyten zu untersuchen, wurde der LTRPC2 kloniert und funktionell charakterisiert. Mit Hilfe der RT-PCR wurden zwei bislang unbekannte Spleißvarianten des LTRPC2 in neutrophilen Granulozyten identifiziert. Durch geeignete Klonierungsstrategien konnten die Spleißvarianten zu vier verschiedenen Varianten des LTRPC2 mit einer Deletion im N-Terminus und/oder einer Deletion im C-Terminus (LTRPC2; LTRPC2-deltaC; LTRPC2-deltaN; LTRPC2-deltaN-deltaC) miteinander kombiniert werden. Funktionelle Untersuchungen an heterolog transfizierten Zellen mit Hilfe von fluorometrischen Messungen der [Ca^(2+)]i, sowie über Messung von Ionenströmen mittels der Patch-Clamp Technik ergaben, daß, im Gegensatz zu den klassischen TRP-Proteinen, keine der LTRPC2 Varianten in Abhängigkeit mit dem PLC-gesteuerten Signaltransduktionsweg stimuliert wird. NAD^(+) sowie der Metabolit ADP-Ribose, wurden im Laufe dieser Arbeit als Agonisten des LTRPC2 identifiziert. Eine Stimulation durch ADP-Ribose ist nur beim LTRPC2 in seiner ungespleißten Form zu sehen. Eine Stimulation des LTRPC2 durch NAD^(+) konnte dagegen mit keiner der LTRPC2 Varianten reproduziert werden. Bei der Aktivierung des LTRPC2 durch ADP-Ribose war eine Veränderung des Redox-Potentials der Zelle in Betracht zu ziehen, wobei H2O2 als Modell für oxidativen Streß gewählt wurde. In diesem Zusammenhang konnte gezeigt werden, daß es durch H2O2 zu einer Aktivierung des LTRPC2, sowie zu einer Aktivierung der Spleißvariante LTRPC2-deltaC kommt, welche nicht auf eine Stimulation mit ADP-Ribose reagiert. Daraus kann geschlossen werden, daß zur Aktivierung der Kanäle mit H2O2 ein eigenständiger Regulationsmechanismus, parallel zur Regulation mit ADP-Ribose, existiert. Die Wirkung von H2O2 ist auf intrazelluläre, oxidative Prozesse zurückzuführen, da die Applikation des Antioxidans Mannitol eine Stimulation von LTRPC2 und LTRPC2-deltaC durch H2O2 verhindert. Diese Ergebnisse lassen vermuten, daß bei der Aktivierung neutrophiler Granulozyten während des Entzündungsgeschehens der Stimulation von LTRPC2 Varianten durch H2O2 eine Bedeutung zukommt.

It has been proposed that transient receptor potential channels (TRP-channels) participate in ligand gated Ca^(2+) entry in non-excitable cells. To analyze the physiological relevance of TRP-channels human neutrophile granulocyte were chosen as a model for non-excitable cells. The activation of neutrophiles is accompanied by membrane depolarisation and by a rise of the [Ca^(2+)]i. Until now the identity of the proteins which initiate the activation of neutrophile granulocytes is not known. Among the TRP-channels, the LTRPC2 is predominantly expressed by neutrophile granulocytes. To investigate the relevance of LTRPC2 for the function of neutrophile granulocytes, LTRPC2 was cloned by the RT-PCR technique and was then heterologously transfected in CHO- and in HEK 293 cells for functional characterisation. Two splice variants of the LTRPC2 were identified in human neutrophile granulocytes. These splice forms were used to construct four alternative variants with deletions at the N-terminal and/or C-terminal domain (LTRPC2; LTRPC2-deltaC; LTRPC2-deltaN; LTRPC2-deltaN-deltaC) using an appropriate cloning strategy. Fluorometric measurments of the [Ca^(2+)]i and measurment of ionic currents of heterologously transfected cells with patch clamp revealed no activation of the LTRPC2 variants in dependence of an intracellular Ca^(2+) store depletion. This stands in contrast to the classical TRP-proteins. Since NAD^(+) and its metabolite ADP-ribose have recently been reported to activate LTRPC2, I analysed the response of LTRPC2 variants to NAD^(+) and ADP-ribose. Whereas no activation by NAD^(+) was observed in any LTRPC2 variant, ADP-ribose exerted a stimulating effect exclusively on the full-lenght LTRPC2. Since ADP-ribose can be formed from NAD^(+), and NAD^(+) is elevated during oxidative stress, it was tested wether the various LTRPC2 channel variants mediate cation influx in response to an oxidant. Therefore ion currents and the [Ca^(2+)]i were measured after stimulating transfected cells with H2O2 as a model of oxidative stress. A stimulation with H2O2 could be observed in cells transfected with full-length LTRPC2 or transfected with the variant LTRPC2-deltaC. Thus the activation of LTRPC2 by H2O2 is independent of ADP-ribose because the splice variant LTRPC2-deltaC was exclusively activated by H2O2, while full-length LTRPC2 could be activated by ADP-ribose as well. Since intracellular application of the antioxidant mannitol prevented a stimulation of LTRPC2 and LTRPC2-deltaC by H2O2, it can be concluded that H2O2 does not act directly on the channel but by intracellular oxidation reactions. It is possible that the activation of LTRPC2 plays a role for the stimulation of neutrophile granulocytes during inflammation, when neutrophiles become activated by H2O2.

Fulltext:
PDF
(additional files)