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000059365 1001_ $$0P:(DE-82)054563$$aNellessen, Cordula Margarete$$b0$$eAuthor
000059365 245__ $$aModifikation der enzymatischen Mutationsdetektionsmethode (EMD) zur Identifikation von Punktmutationen im PMP22-Gen nach DNA-Isolierung aus Nerv, Muskel oder Blut$$cvorgelegt von Cordula Margarete Nellessen geb. Fuchs$$honline, print
000059365 260__ $$aAachen$$bPublikationsserver der RWTH Aachen University$$c2003
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000059365 5203_ $$aBei den hereditären motorisch-sensorischen Neuropathien (HMSN) handelt es sich um eine Gruppe genetisch determinierter Erkrankungen des peripheren Nervensystems, deren Klinik von einer chronisch progredienten, symmetrischen Schwäche und Atrophie der distalen Extremitätenmuskulatur sowie Sensibilitätsstörungen geprägt ist. Die Einteilung in Subtypen aufgrund von Klinik und Morphologie ist bei sehr heterogener phänotypischer Ausprägung oft erschwert. Hierfür und auch zum tieferen Verständnis der zugrunde liegenden Pathomechanismen sind molekulargenetische Analysen besonders wichtig. In der vorliegenden Studie wurde die DNA von 59 HMSN Patienten auf Sequenzveränderungen im codierenden Bereich des PMP22-Gens, welches für ein Transmembranprotein der Myelinscheide kodiert, untersucht. Nach Isolierung der DNA wurden die vier kodierenden Exone per PCR vervielfältigt. Anschließend wurden die Amplifikationsprodukte der Enzymatischen Mutationsdetektionsmethode (EMD) unterzogen: Liegt eine heterozygote Punktmutation vor, bildet sich bei der Hybridisierung zweier amplifizierter DNA-Stränge eine Fehlpaarung aus, die durch die T4 Endonuklease VII erkannt wird. Das Enzym schneidet dann den DNA-Doppelstrang an dieser Stelle. Die Analyse der Fragmente erfolgte erstmalig auf dem ABI Prism 310, einem Kapillarelektrophoresesystem, welches fluoreszenzgelabelte DNA-Stränge ihrer Länge entsprechend auftrennt und detektiert. Die Adaptation der EMD auf dieses System machte verschiedene Optimierungsschritte erforderlich. Zur exakten Identifikation eines Basenaustausches wurden im Screening auffällige Proben der Automatisierten DNA-Sequenzanalyse unterzogen. Es gelang, für 58 Patienten eine Mutation im PMP22-Gen sicher auszuschließen. Bei einem Patienten konnte eine heterozygote Punktmutation im Exon 3 (Codon 97, Austausch der dritten Base Cytosin gegen Thymin) identifiziert werden. Diese verändert die Aminosäuresequenz nicht, so dass hier von einem Polymorphismus ohne Krankheitswert ausgegangen werden kann. So unterstreichen die Ergebnisse die Seltenheit von Sequenzvarianten des PMP22-Gens und bieten eine Basis für Analysen anderer mit HMSN assoziierter Gene (P0, EGR2, CX32 etc.). Zudem konnte durch die Adaptation und Optimierung der EMD für den ABI PRISM 310 eine hochaktuelle Methode mit nahezu hundertprozentiger Sensitivität für ein effizientes Mutationsscreening etabliert werden und erstmalig in Kombination mit der Automatisierten DNA Sequenzanalyse für die Suche nach Punktmutationen bei HMSN Patienten eingesetzt werden.$$lger
000059365 520__ $$aHereditary Motor and Sensory Neuropathies (HMSN) are a group of genetically determined disorders of the peripheral nervous system, which are clinically characterised by chronic, progressive weakness of the lower limbs, muscular atrophy and sensibility disorders. Phenotypic variability, however, is quite great, which makes it often difficult to identify the exact HMSN subtype. Therefore and for a better understanding of the underlying pathological mechanisms, molecular genetic analysis is very important. In this study, DNA form 59 patients was examined for point mutations in the PMP22-Gene, which codes for a transmembrane protein in the myelin sheath. After DNA-extraction, the four coding exons of the gene were amplified by PCR. Then, the templates were analysed by the Enzymatic Mutation Detection Method (EMD): In case of a heterozygous point mutation, hybridisation of two amplified DNA strands causes a base pair mismatch, which is detected by the T4 Endonuclease VII. The enzyme cleaves the DNA duplex at that point. For the first time, the fragments were analysed on the ABI Prism 310. Based on capillary electrophoresis, this system separates and detects fluorescence labelled DNA-fragments. To adapt EMD for the ABI Prism and optimise the results, several steps had been necessary. A presumed base exchange was identified exactly by Automatic Sequencing Analysis. In 58 patients, a mutation in the PMP22-gene was excluded. In one patient, a heterozygous point mutation was identified in exon 3 (codon 97, exchange of the third base Cytosin with Thymin). As this exchange does not alter the amino acid sequence, this mutation is assumed to be a polymorphism without pathological effect. To summarize, these results show how rare sequence variations in the PMP22-gene are and form the base for further investigations (e.g. the analysis of other with HMSN associated genes as P0, EGR2, CX32 etc.). Moreover, adapting and optimizing EMD for the ABI Prism 310 allowed the use of a very modern, efficient and reliable screening method with a sensitivity of nearly 100%. For the first time, this method has been used in combination with Sequencing Analysis to search for point mutations in HMSN Patients.$$leng
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