Analysen zur Funktion von Mehmet, einem neuen Interaktionspartner des Transkriptionsfaktors AP-2-alpha, sowie Charakterisierung von Mehmet in Drosophila melanogaster

Septinus, Anja; Büttner, Reinhard

doi:891

Analysen zur Funktion von Mehmet, einem neuen Interaktionspartner des Transkriptionsfaktors AP-2-alpha, sowie Charakterisierung von Mehmet in Drosophila melanogaster

Septinus, Anja (Author)

2004

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Anja Septinus

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2004

Umfang161 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2004

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Büttner, Reinhard (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2004-07-20

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-8914
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/59534/files/Septinus_Anja.pdf

Einrichtungen

Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften (100000)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Taufliege (Genormte SW) ; Transkriptionsfaktor (Genormte SW) ; cDNS (Genormte SW) ; Wechselwirkung (Genormte SW) ; Biowissenschaften, Biologie (frei) ; Mehmet (frei) ; Transkriptionsfaktor AP-2alpha (frei) ; Drosophila melanogaster (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
AP-2 Transkriptionsfaktoren bilden eine Familie aus fünf evolutionär konservierten DNS-Bindeproteinen (AP-2alpha, AP-2beta, AP-2gamma, AP-2delta und AP-2epsilon). Charakteristisches Merkmale sind ein N-terminal transkriptionsaktivierendes prolin- und glutaminreiches Motiv und ein basisches und alpha-helikales Motiv (Helix-Span-Helix) im C-Terminus, das neben der sequenzspezifischen DNS-Bindung gleichzeitig die Dimerisierung vermittelt. AP-2 Transkriptionsfaktoren wurde eine regulatorische Schlüsselfunktion, in der Tumorgenese, der Kontrolle und Regulation bestimmter Zellzyklus- und Apoptose-Effektoren und in der embryonalen Zelldifferenzierung nachgewiesen. Durch einen Far-Western-Screen wurde ein neuartiges AP-2alpha interagierendes Multidomänenprotein identifiziert. Die cDNS kodiert für ein Protein von 1306 Aminosäuren mit einem kalkulierten Molekulargewicht von etwa 144kDa. Das Protein lässt sich in drei Abschnitte mit jeweils charakteristischen Sequenzmerkmalen einteilen. Der N-Terminus zeigt Homologien zu verschiedenen Hefe-Proteinen (Y-Box), dem eine kurze saure Region folgt. Im zentralen Bereich wurden Homologien zu 5'-Cytosin-DNS-Methyltransferasen und zum Drosophila Trithorax Protein gefunden. Basierend darauf erfolgte die Namensgebung Mehmet (Protein containing MECP-1 homology region similar to DNS Methyltransferase and mammalian trithorax proteins). Die C-terminale Region zeigt zwei gekoppelte Homologien bestehend aus einem F-Box und Leucin-Repeat Motiv. Expressions-Analysen konnten ein 4,4kB grosses Transkript von Mehmet in Leber und Niere und zudem eine Mehmet Expression in Gehirn, Hoden, Milz und Herz nachweisen. Anhand dieses Expressionsmuster konnte eine Überlappung der Expressionsorte von AP-2alpha und Mehmet bestätigt werden. GST Interaktionsexperimente konnten nachgeweisen, dass AP-2alpha in vitro spezifisch an Mehmet bindet und Mehmet außerdem mit AP-2beta und AP-2gamma interagiert. Durch Immunfluoreszenzstudien konnte bewiesen werden, dass die Überexpression von AP-2alpha und Mehmet eine erhöhte Lokalisation von Mehmet im Zellkern zeigt. Um Hinweise bezüglich der Funktion von Mehmet zu finden, wurde ein transgenes Zellmodell mit einer regulierbaren starken Proteinexpression von Mehmet entwickelt. Die Beteiligung von Mehmet an einer möglichen Proteasom-vermittelten Degradation von AP-2alpha wurde anhand eines in Western Blot-Analysen gezeigten konstanten AP-2alpha Spiegel zurückgewiesen. Experimente zur Bestimmung der Zellproliferation und Apoptoserate konnten keine funktionelle Beeinträchtigung bei Überexpression von Mehmet in den verschiedenen Zell-Klonen zeigen. Datenbank-Analysen konnten ein hoch konserviertes Mehmet-Gen in Drosophila melanogaster identifizieren (dMehmet). Northern Blot- und RT-PCR-Analysen konnten ein durchgehendes Expressionsmuster von dMehmet in nahezu allen Entwicklungsstadien von Drosophila melanogaster nachweisen.

AP-2 transcription factors represent a family of five closely related and evolutionarily conserved DNA-binding proteins termed AP-2alpha, AP-2beta, AP-2gamma, AP-2delta and AP-2epsilon. They are characterized by an unique modular structure consisting of an aminoterminal transcriptional activation domain and a complex helix span helix motif for dimerization and DNA binding. AP-2 proteins have been suggested to regulate a variety of target genes, embryonic development, apoptosis and differentiation. Here we report the characterization of Mehmet, a potential new AP-2 interacting protein, isolated by Far Western screening. The cDNA encodes a 1306 aa protein with a molecular mass of apparently 150 kD. Sequence analysis revealed 3 main domains: The N-terminal region shows homology to different yeast-proteins (Y-Box), followed by an acidic region. Homology with 5‘ cytosine DNA methyltransferase and Drosophila trithorax protein was found in the central section, causing the name Mehmet (protein containing MECP-1 homology region similar to DNA-methyltransferase and mammalian trithorax proteins). The C-terminal domain is homologue to F-box- and leucin motives. Expression analysis revealed a 4.4 kb Mehmet transcript in liver and kidney, correlating to the expression pattern of AP-2alpha, and expression was also shown in brain, testis, spleen and heart. To confirm interaction between AP-2 and Mehmet in vitro and in vivo we performed GST pull down – and IP experiments. AP-2alpha, AP-2beta and AP-2gamma were tested and showed a positive result in GST-pull down assay used for the confirmation of AP-2/Mehmet interaction. Immunofluorescence microscopy revealed a translocation of Mehmet within the cell from cytoplasm into the nucleus. To understand the function we established stable transfectants with inducibly Mehmet expression. Potential degradation of AP-2alpha by Mehmet was researched and constant level of AP-2alpha in Western-Blot analysis proved that Mehmet has no influence on the stability of AP-2alpha. Proliferation and apoptosis assays demonstrated no functional interference for inducible expression of Mehmet. Data search analysis identified a highly conserved Mehmet-gene in Drosophila melanogaster (dMehmet). Expression Analysis of dMehmet by Northern Blot, RT-PCR and in situ hybridisation confirm a persistent expression pattern of dMehmet during Drosophila development.

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