Der spannungsgesteuerte Chloridkanal CIC-2 und seine Bedeutung in der Pathogenese von idiopathischer generalisierter Epilepsie

Warnstedt, Maike Ursula; Fahlke, Christoph

doi:25839

Der spannungsgesteuerte Chloridkanal CIC-2 und seine Bedeutung in der Pathogenese von idiopathischer generalisierter Epilepsie

Warnstedt, Maike Ursula (Author)

2004

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Maike Ursula Warnstedt

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2004

UmfangIII, 116 S. : graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2004

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Fahlke, Christoph (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2004-05-26

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-9526
DOI: 10.18154/RWTH-CONV-121383
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/59613/files/59613.pdf

Einrichtungen

Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften (100000)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Biowissenschaften, Biologie (frei) ; ClC-2 (frei) ; Chloridkanal (frei) ; Aktivierung (frei) ; transmembraner Chlorid-Gradient (frei) ; Epilepsie-Mutationen (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
ClC-2 gehört zur ClC-Familie spannungsabhängiger Chlorid-Kanäle. Innerhalb dieser Kanalfamilie zeigt er eine einzigartige Aktivierung durch Hyperpolarisation, niedrigen pH-Wert und hypotones Medium. In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene biophysikalische Eigenschaften des humanen ClC-2 Kanals erstmals funktional charakterisiert und mit denen der Ratten-Isoform verglichen. Dazu wurden beide Proteine heterolog in tsA201-Zellen exprimiert und mit Hilfe der Patch-Clamp Technik in der whole-cell Konfiguration elektrophysiologisch untersucht. hClC-2 und rClC-2 unterscheiden sich in ihren Aktivierungseigenschaften kaum. Beide Kanäle sind bei positiven Spannungen weitgehend geschlossen und aktivieren langsam bei Hyperpolarisation. Der humane ClC-2 besitzt jedoch eine langsamere Aktivierungs- und Deaktivierungskinetik als der Ratten-Kanal. Für den zytoplasmatischen N-Terminus von ClC-2 konnte eine früher hypothetisierte Funktion als Inaktivierungsdomäne nicht bestätigt werden. Das nahezu unveränderte Schaltverhalten einer entsprechenden Deletionsmutante spricht gegen das von anderen Autoren vorgeschlagene Modell zur Inaktivierung dieses Kanals. Dennoch wird durch die hier nachgewiesene geänderte Kinetik der Mutante eine wichtige Rolle des N-Terminus beim Schaltverhalten von ClC-2 impliziert. Weiterhin konnte belegt werden, daß der Block des ClC-2 Stromes durch extrazelluläres Iodid sowohl vom Membranpotential als auch vom Konformationszustand des Kanals abhängt, was ebenfalls gegen die Existenz einer zytoplasmatischen Inaktivierungsdomäne spricht. Desweiteren konnte eine Abhängigkeit des Aktivierungsverhaltens von ClC-2 vom transmembranen Chlorid-Gradienten nachgewiesen werden: der Kanal aktiviert nur bei Spannungen negativ des Chlorid-Umkehrpotentials und vermittelt deshalb ausschließlich einen Cl-Ausstrom. Aufgrund dieser Eigenschaft wurde ein Modell zur Funktion von ClC-2 bei der neuronalen Chlorid-Homöostase entwickelt, das dem Kanal eine große Bedeutung bei der Aufrechterhaltung eines niedrigen intrazellulären Chloridgehalts zuschreibt. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden drei Mutationen von ClC-2 untersucht, die kürzlich in Patienten mit idiopathischer generalisierter Epilepsie (IGE) identifiziert wurden. Zwei dieser Mutationen, M200fsX231 und del74-117, erwiesen sich sowohl in homo- als auch in heterodimerer Form mit einer Wildtyp-Untereinheit als nicht-funktionell. Ein korrekter Transport der mutierten Proteine zur Zellmembran wurde durch fluorometrische Messungen belegt und konnte deshalb als Grund für den dominant-negativen Effekt dieser Mutationen ausgeschlossen werden. Ob die fehlende Funktionalität durch eine mangelnde Interaktionsfähigkeit der mutierten mit ClC-2 Wildtyp-Untereinheiten verursacht wird, war durch FRET-Messungen nicht eindeutig nachweisbar. Der durch die Mutationen verursachte Funktionsverlust von ClC-2 Kanälen führt in betroffenen Patienten mutmaßlich zu einer intrazellulären Chlorid-Akkumulation, was in einer exzitatorischen GABA-Antwort und neuronaler Übererregbarkeit resultieren kann und somit eine Erklärung für den epileptischen Phänotyp darstellt. Die dritte IGE-Mutation, G715E, beeinträchtigt zwar nicht die Funktionalität von ClC-2, hat jedoch eine Veränderung des Aktivierungsverhaltens zur Folge: mutierte Kanäle öffnen bereits bei weniger negativen Membranpotentialen als die Wildtyp-Isoform. Unter bestimmten Bedingungen, z.B. während der Repolarisation nach intensiver synaptischer Aktivität, können sie so einen vermehrten Chlorid-Ausstrom vermitteln, was zu einer wiederholten Depolarisation der Zelle und zum erneuten Auftreten von Aktionspotentialen führen könnte. Das Auftreten epileptischer Anfälle wird hier folglich durch einen anderen Mechanismus verursacht, der einen Funktionszugewinn von ClC-2 beinhaltet. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit heben die Bedeutung des Schaltverhaltens von ClC-2 für seine Funktion hervor und etablieren CLCN2 als krankheitsverursachendes Gen in idiopathischen Epilepsien.

ClC-2 is a member of the ClC-family of voltage-gated chloride channels. Within this family, ClC-2 is unique in being activated by hyperpolarization, low extracellular pH and hypotonic cell swelling. In this study, several biophysical properties of the human ClC-2 channel have been functionally characterized for the first time and compared with the corresponding properties of the rat isoform. Both proteins were expressed heterologously in tsA201-cells and were analyzed electrophysiologically using the whole-cell patch-clamp technique. hClC-2 and rClC-2 hardly differ in their activation properties. Both channels are virtually closed at positive potentials and activate slowly upon hyperpolarization. However, the human ClC-2 displays slower activation and deactivation kinetics than the rat isoform. A formerly hypothesized function as an inactivation domain for the cytoplasmatic N-terminus of ClC-2 could not be verified. A corresponding N-terminal deletion mutant exhibits a nearly unchanged gating behaviour which argues against the proposed inactivation model for this channel. However, the changed kinetics of the mutant imply an important role of the N-terminus in gating of ClC-2. Furthermore, it could be shown that the current block by external iodide is dependent on the membrane potential as well as on the conformational state of the channel. This argues against the existence of an intracellular inactivation domain as well. A dependence of the activation behaviour of ClC-2 on the transmembrane chloride gradient could be proven: the channel activates only at potentials negative to the reversal potential and therefore constitutes an exclusive efflux pathway for chloride ions. Based on this property, a model for the role of ClC-2 in neuronal chloride homeostasis has been proposed assigning the channel an important function in establishing and maintaining a low intracellular chloride concentration. In the second part of this work, three mutations of ClC-2 were studied that have recently been identified in patients with idiopathic generalized epilepsy (IGE). Two of these mutants, M200fsX231 and del74-117, were non-functional, neither as homodimers nor as heterodimers with one wildtype subunit. A correct trafficking of the mutated proteins to the cell membrane was demonstrated by fluorometric experiments and could therefore be discarded as possible cause for the dominant-negative effect of these mutations. Whether the lack of functionality is due to the missing ability of the mutated subunits to interact with wildtype subunits could not be shown unambiguously in FRET experiments. The loss of ClC-2 function in patients carrying these mutations might lead to an intracellular chloride accumulation that could result in an excitatory GABAergic response and neuronal hyperexcitability and thus represent a possible explanation for the epileptic phenotype. The third IGE mutation, G715E, does not impair the functionality of ClC-2 but leads to an altered voltage-dependence of channel gating: mutated channels open already at less negative potentials than the wildtype isoform. Under certain conditions, for example during the repolarization phase after intense synaptic activity, they conduct an increased outward chlorid current possibly leading to recurrent membrane depolarization and repeated action potentials. The G715E mutation therefore seems to cause epileptic seizures by a distinct mechanism comprising a gain-of-function of ClC-2. The results of this thesis demonstrate the importance of gating in ClC-2 for its function and establish CLCN2 as a disease-causing gene in idiopathic epilepsies.

OpenAccess:
PDF
(additional files)