Pflanzenzellen als Produktionssystem zur Gewinnung von Interleukin-4 Doppelmutein (IL-4 DM)

Raven, Nicole; Fischer, Rainer

doi:HT014240374

Pflanzenzellen als Produktionssystem zur Gewinnung von Interleukin-4 Doppelmutein (IL-4 DM)

Raven, Nicole (Author)

2004

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Nicole Raven

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2004

UmfangIV, 185 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2004

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Fischer, Rainer (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2004-12-07

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-9918
DOI: 10.18154/RWTH-CONV-208168
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/59712/files/59712.pdf

Einrichtungen

Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften (100000)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Biowissenschaften, Biologie (frei) ; pflanzliche Expressionssysteme (frei) ; Tabak (frei) ; BY-2 (frei) ; rekombinante pharmazeutische Proteine (frei) ; molecular farming (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Ziel dieser Arbeit war es, im Rahmen der Bayer-FhG Kooperation „A feasibility study for recombinant protein production in plants“ die Möglichkeiten pflanzlicher Expressionssysteme zur Produktion pharmazeutischer Proteine am Beispiel des potentiellen Anti-Allergikums IL-4 DM (Doppelmutein) zu bestimmen. Das Protein wurde in Tabakpflanzen und Tabaksuspensionszellen des Kultivars BY-2 exprimiert, so daß zwei grundsätzlich verschiedene pflanzliche Produktionsplattformen verglichen werden konnten. Zur Steigerung der Proteinexpression wurde die IL-4 DM Gensequenz für Pflanzenzellen optimiert und synthetische IL-4 DM Genversionen mittels PCR-Technologie hergestellt. Bei der Analyse der verschiedenen Konstrukte in transienten Transformationen wurde allerdings nachgewiesen, daß die Kodonoptimierung keinen positiven Effekt auf die Expression von IL-4 DM in Tabak hat. Die Akkumulation von IL-4 DM wurde für beide Produktionssysteme in verschiedenen Zellkompartimenten untersucht. Die apoplasmatische Proteinlokalisation lieferte im Vergleich zur ER-Retardierung des Proteins stets die höchsten Akkumulationsmengen. Tabakpflanzen wurden stabil transformiert, und die Expression von apoplasmatisch lokalisiertem IL-4 DM konnte für Transgene der T0-und der T1-Generation nachgewiesen werden, wobei die Proteinausbeuten bei bis zu 5 µg pro Gramm Blattmaterial lagen. In transgenen BY-2 Suspensionszellen wurde IL-4 DM mit hoher Effizienz sekretiert und konnte direkt aus dem Kulturüberstand geerntet werden. Die Produktion des Proteins ließ sich durch Übertransformation transgener BY-2 Zellinien mit IL-4 DM Konstrukten, die alternative IL-4 DM Gensequenzen und Selektionsmarker trugen, um den Faktor 5-10 auf bis zu 1,5-3,8 µg pro ml Kulturmedium steigern. Ausgehend von etablierten Reinigungsprotokollen für das bakteriell exprimierte IL-4 DM Protein wurden Strategien zur Reinigung des Proteins für die untersuchten Pflanzensysteme entwickelt. Die Reinigungsschritte beruhten auf der Ausnutzung der physikalisch-chemischen Eigenschaften von IL-4 DM und ermöglichten die Anreicherung von funktionalem IL-4 DM sowohl aus Blattextrakt als auch aus BY-2 Kulturüberstand. Die Funktionalität des pflanzlich produzierten IL-4 DM wurde durch in vitro Bindung an IL-4 Rezeptor überexprimierende humane Zellinien nachgewiesen. Für das BY-2 System konnte die korreke Abspaltung des Signalpeptids vom IL-4 DM Protein uneingeschränkt bestätigt werden, wohingegen das rekombinante IL-4 DM aus Tabakblättern zu 66% zusätzlich die letzte Aminosäure des Signalpeptids enthielt. IL-4 DM wird in Pflanzenzellen glykosyliert produziert, dabei wichen die Glykosylierungsmuster des Proteins – unter anderem aufgrund des Vorhandenseins von pflanzenspezifischerAlpha -1,3 verknüpfter Fucose und b-1,2 verknüpfter Xylose – geringfügig von den typischen Glykosylierungsmustern in Säugetierzellen ab. Es wurden außerdem Unterschiede in den Glykosylierungsmustern von IL-4 DM zwischen dem BY-2 System und aus Tabakblättern identifiziert. Im Rahmen der vorliegenden Studie konnte die hohe Qualität des pflanzlich produzierten IL-4 DM anhand biochemischer Untersuchungen belegt und somit die grundsätzliche Eignung von Pflanzenzellen für die Herstellung von funktionalem IL-4 DM nachgewiesen werden.

The present study has emerged from the Bayer-FhG joint project on "A feasibility study for recombinant protein production in plants". Its objective was to analyse and evaluate the extent to which plant expression systems would be able to produce pharmaceutical proteins; the test protein chosen for this feasibility study was IL-4 DM (double mutein). The protein was expressed in tobacco plants and in tobacco suspension cells of the cultivar BY-2, making it possible to compare two fundamentally different plant production platforms. In order to increase the level of protein expression, the IL-4 DM gene sequence was optimised for plant cells; by drawing on PCR technology, synthetic versions of the gene were generated. The analysis of various gene constructs in transient transformations showed, however, that codon optimisation had no positive effect on the expression of IL-4 DM in tobacco. The accumulation of IL-4 DM was scrutinised in various cell compartments in both production systems. Comparing apoplasmatic localisation of the protein and ER-retardation of the protein, it was found that highest amounts of accumulation were given in the former case. Tobacco plants were stably transformed, and it was proven that apoplasmatically localised IL-4 DM was in fact expressed in transgenics of the T0 and the T1 generation; the protein yields reached up to 5 µg per gram leaf material. In transgenic BY-2 suspension cells, IL-4 DM was secreted highly efficiently and could be harvested from the culture supernatant directly. It was possible to increase the level of protein production by the factor 5 to 10, resulting in 1.5 to 3.8 µg per ml culture medium, by means of an overtransformation of transgenic BY-2 cell lines with IL-4 DM constructs carrying alternative IL-4 DM gene sequences and selection markers. Starting off from established purification protocols for bacterially expressed IL-4 DM protein, new strategies for the purification of the protein were developed for the plant systems at hand. The individual stages of purification were such that they utilised the physico-chemical properties of IL4-DM and that they made it possible to accumulate functional IL-4 DM that had been obtained both from leaf extract and from BY-2 culture supernatant. The functionality of IL-4 DM produced in plants was verified by means of in vitro binding to human cell lines overexpressing IL-4 receptor. Evidence was produced to show that the signal peptide was correctly cleaved from the IL-4 DM protein in the BY-2 system. In contrast, it transpired that 66% of the recombinant IL-4 DM from tobacco leaves included the last amino acid of the signal peptide. IL-4 DM is produced in plant cells in a glycosylated form. However, the patterns of glycosylation of the protein deviated marginally from the patterns of glycosylation typically found in mammalian cells, major reasons for such deviations being the presence of plant-specific Alpha-1,3 linked fucose and ß-1,2 linked xylose. Furthermore, it was shown that there are differences in the patterns of glycosylation of IL-4 DM between the BY-2 system on the one hand and tobacco leaves on the other. The results of biochemical tests gave evidence of the high quality of IL-4 DM produced in plants and thus proved the principal suitability of plant cells for the production of functional IL-4 DM.

OpenAccess:
PDF
(additional files)