Phytoextraction of heavy metal from contaminated soils using genetically modified plants

Daghan, Hatice; Schäffer, Andreas

doi:urn:nbn:de:hbz:82-opus-9955

Phytoextraction of heavy metal from contaminated soils using genetically modified plants

Daghan, Hatice (Author)

2004

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Hatice Daghan

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2004

Umfang111 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2004

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Schäffer, Andreas (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2004-12-07

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-9955
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/59730/files/Daghan_Hatice.pdf

Einrichtungen

Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften (100000)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Boden (Genormte SW) ; Schwermetallbelastung (Genormte SW) ; Phytoremediation (Genormte SW) ; Tabak (Genormte SW) ; Transgene Pflanzen (Genormte SW) ; Biowissenschaften, Biologie (frei) ; Phytoextraction (frei) ; Metallothioneins (frei) ; Cadmium (frei) ; Transgenic Plants (frei) ; Heavy Metals (frei) ; Tobacco (frei) ; Hyperaccumulators (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Phytoremediation durch Pflanzen stellt eine kostengünstige und nachhaltige Methode zur Sanierung schwermetallbelasteter Böden dar. Ansätze zur Entwicklung transgener Pflanzen mit effektiven phytoremediativen Eigenschaften ist deshalb von hohem Interesse (Krämer, et al. 2001). Diese Arbeit beschreibt die Verwendung der MTII-Gene aus Chinese Hamster (ChMTII) und Syccharomyces cerevisiae (ScMTII) zur Generierung transgener Tabakpflanzen mit verbesserten Extraktions- und Akkumulationseigenschaften, sowie erhöhter Toleranz gegenüber Schwermetallen. ChMTII und ScMTII wurden aus cDNA amplifiziert. Pflanzenkonstrukte dieser MTII mit unterschiedlichen Vakuol-Zielsequenzen zur transienten und stabilen Exppression kloniert, in Tabakpflanzen transformiert und auf Lokalisation, Stabilität und Akkumulationsgrad hin untersucht. Die Lokalisation der MTIIs in der Vakuole wurde in transient- und stabil-expremierenden Pflanzen durch Immunogold-Markierung bestätigt, wohingegen die funktionale Expression von ChMTII und ScMTII mittels Immuno-Blott-Analyse erfolgte. Die höchste Akkumulation in der Vakuole zeigte dabei das Konstrukt cV-ChMTII. Linien mit hohen Akkumulationsraten wurden für die Etablierung homozygoter Linien verwendet. Die T1-Generation der S-ChMTII (Linie 8) und S-ScMTII (Linie 24) und die T2-Generation der cV-ChMTII-GFP (Linie 13/3) wurden für die Evaluierung der in vivo MTII-Protein-Funktion unter Verwendung der Hydro- und Bodenkultur analysiert. In der Hydrokultur zeigten die cV-ChMTII-GFP transgenen Pflanzen hohe Akkumulation des MTII-Proteins im Pflanzenspross und in den Wurzeln, außerdem wurde eine ausgeprägte Toleranz gegenüber Cadmium verbunden mit hoher Biomasse beobachtet. Die Cadmium-Toleranz in Transgenen- und Wildtyppflanzen betrug bis zu 50 µM. Oberhalb dieser Konzentration, sank die Biomasse, die Akkumulation von Cadmium und die Toleranz gegenüber dem Schwermetall. Im Bodenexperiment zeigten die Transgenen- und Wildtyppflanzen bei einer Behandlung bis 30 µM Cadmium weder hinweise auf Schädigung, noch unterschiede im Trockengewicht der Blätter, Pflanzensprosse und Blütenstände. Versuche mit höheren Cadmium-Konzentrationen müssen durchgeführt werden, um die transgenen Linien mit erhöhter Fähigkeit zur Akkumulation zu identifizieren. Anhand der Ergebnisse aus Hydro- und Bodenkultur wurde demonstriert, dass die klonierten MTII in der Vakuole akkumulieren. Zwar sind weitere Analysen erforderlich, doch zeigt diese Arbeit, dass im Vergleich zu konventionellen Extraktionsmethode die molekularbiologisch veränderten, zur Phytoremediation befähigten transgenen Pflanzen eine interessante und zugleich viel versprechende Möglichkeit zur umweltfreundlichen Sanierung von Schwermetallbelasteten Böden darstellen.

The use of plants to clean-up soils contaminated with trace elements could provide a cheap and sustainable technology for phytoremediation. The introduction of novel traits into plants that produce high levels of biomass using a transgenic approach is a promising strategy for the development of effective phytoremediation technologies (Krämer, et al. 2001). This thesis describes the use of recombinant Chinese hamster and Saccharomyces cerevisiae MTIIs for generating transgenic tobacco plants with improved extraction, accumulation and tolerance to heavy metals. The ChMTII and ScMTII were amplified from cDNA and subcloned into plant expression vectors for transient expression in the vacuole. Detailed characterization of recombinant vacuolar targeted ChMTII-GFP fusion; ChMTII and ScMTII were carried out on stably transformed tobacco plants obtained by Agrobacterium-mediated transformation. The MTIIs were cloned into the pTRA-kc plant expression vector and analyzed for their stability and accumulation levels in the plant vacuole. Lines with the highest accumulation levels were selected for establishing homozygous lines. Functional expression of ChMTII and ScMTII in the vacuole of transgenic tobacco plants was confirmed by immunoblot and immunogold analyses. Immunoblot analysis indicated that high accumulation of the recombinant proteins was achieved in tobacco plants transformed with the cV-ChMTII-GFP construct, whereas the lower protein accumulation was observed for the S-ScMTII. Immunogold labelling experiments were carried out on transiently and stably transformed tobacco plants demonstrated that MTIIs localized to the vacuole. The T2 generation of tobacco lines expressing recombinant cV-ChMTII-GFP (line 13/3) as well as the T1 generation of the S-ChMTII (line 18) and S-ScMTII (line 24) were used for evaluating in vivo protein function with two cultivation system: hydroponic culture and soil. The levels of accumulation for the recombinant MTIIs in shoots and roots decreased with increasing concentration of Cd supplied with the nutrient solution. Transgenic plants that were transformed with the cV-ChMTII-GFP construct showed the highest expression of MTII protein in shoots and roots and a higher degree of tolerance to Cd than plants transformed with the S vacuolar targeting cassettes or than wild type plants used as control. The cV-ChMTII-GFP transgenic plants which accumulated high levels of MTII proteins in shoots and roots showed high tolerance to Cd toxicity with high biomass production in hydroponic experiments. Cd tolerance level was up to 50µM Cd for transgenics and wild type tobacco plants. Above this Cd concentration, the production of plant biomass, the accumulation of Cd and the degree of tolerance to the metal were decreasing. To determine the exact concentration threshold for Cd tolerance in the transgenic plants as compared to wild type tobacco plants additional experiment should be carried out. Ideally, the 50-100µM Cd range should be tested in hydroponic experiments. The transgenic and wild type plants in soil experiments didn’t show any toxicity symptoms within a treatment range from 0 to 30 ppm Cd. The dry matter of wild type and transgenic tobacco plants was only slightly affected by the treatment with Cd. Plants transformed with the cV-ChMTII-GFP cassette showed the highest dw compared to the other transgenic lines. However, wild type and transgenic plants showed no significant differences in the dw of leaves, stems and flowers. Further experiments should be carried out with higher cadmium dosage to identify those transgenic lines with improved ability to accumulate and tolerate heavy metals. The data presented in this study demonstrated that heterologous expression and subcellular targeting of MTIIs in tobacco plants was successfully achieved. The results of the hydroponics and soil experiment showed that the characterization of the transgenic tobacco plants might require further studies. However these data indicate that compared to traditional extraction approaches; phytoremediation represents a promising and environmental friendly tool to clean heavy metal from contaminated soils at reduced costs.

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