Klonierung Docosahexaenoyl-CoA-spezifischer Acyltransferase-Gene

Sözer, Nursen; Frentzen, Margarete

doi:1132

Klonierung Docosahexaenoyl-CoA-spezifischer Acyltransferase-Gene

Sözer, Nursen (Author)

2005

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Nursen Sözer

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2005

Umfang109 S. : graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2005

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Frentzen, Margarete (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2005-05-13

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-11320
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/59964/files/Soezer_Nursen.pdf

Einrichtungen

Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften (100000)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Biowissenschaften, Biologie (frei) ; Acyltransferasen (frei) ; sehr langkettige mehrfach ungesättigte Fettsäuren (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Sehr langkettige mehrfach ungesättigte Fettsäuren (LCPUFAs, long chain polyunsaturated fatty acids), sind die dominierenden Fettsäuren in den Membranlipiden der Säuger. Sie sind z. B. für die Nervenfunktion, das Sehen und die Reproduktion essentiell und dienen darüber hinaus als Vorstufe für die Biosynthese der verschiedenen Eicosanoide. Die Biosyntheseraten dieser Fettsäuren sind in Säugern meist zu gering, um ihren Bedarf zu decken und müssen daher mit der Nahrung aufgenommen werden. Transgene Ölsaaten, die LCPUFAs in ihren Samenölen akkumulieren, stellen eine attraktive Möglichkeit für eine nachhaltige Produktion dieser essentiellen Fettsäuren für die menschliche Ernährung dar. Zur Entwicklung solcher transgenen Linien sollten in der vorliegenden Arbeit Gene für Lysophosphatidsäure-Acyltransferasen (LPAAT) kloniert werden, die spezifisch LCPUFAs in die mittlere Glycerinposition der Samenöle einführen. Lipidanalysen führten zur Identifizierung zweier interessanter Organismen, dem Bakterium Shewanella hanedai und dem Pilz Thraustochytrium. Vergleichende enzymatische Untersuchungen mit subzellulären Fraktionen zeigten, dass diese Organismen über LCPUFA spezifische LPAATs in ihren Membranen verfügen. Das S. hanedai-Enzym besitzt eine ausgeprägte Spezifität für C20- und C22-Fettsäuren, wohingegen das Thraustochytrium-Enzym bevorzugt C22-Fettsäuren einbaut. Nach Anlegen und Absuchen einer genomischen Bank von S. hanedai bzw. von cDNA-Expressionsbanken von Thraustochytrium konnten mögliche LPAAT-Sequenzen isoliert werden. Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen zeigten höchste Ähnlichkeiten zu bakteriellen LPAAT-Sequenzen und besitzen die für LPAATs typischen Motive. Die Sequenz von S. hanedai wurde in E. coli funktional exprimiert und zeigt eine ausgeprägte Spezifität für LCPUFAs. Diese Versuche zeigten somit klar, dass das klonierte S. hanedai-Gen eine LPAAT kodiert, die eine Spezifität für LCFUFAs besitzt. Aufgrund der Sequenzähnlichkeiten ist es wahrscheinlich, dass auch das Thraustochytrium-Gen eine solche LPAAT kodiert. Dies konnte allerdings durch Expressionsversuche in E. coli nicht verifiziert werden, da das Thraustochytrium-Protein in E. coli sehr schnell abgebaut wurde. Durch Expression der Thraustochytrium-Sequenz als GST-Fusionsprotein ist es gelungen, das Protein zu stabilisieren und zu reinigen. Allerdings verhindert die Fusion die Ausbildung der katalytisch aktiven Konformation der LPAAT. Nach Expressionsstudien in verschiedenen Organismen waren zur Expression der Thraustochytrium-LPAAT Insektenzellen am besten geeignet.

The most dominating lipids composing mammalian cell membranes are long chain polyunsaturated fatty acids (LCPUFA). They are essential for the correct function of e.g. the nervous and ocular systems as well as for reproduction. Additionally they are precursors for the formation of different eicosanoids. The biosynthesis rate of these fatty acids in mammals is usually low and insufficient to cover their needs. They must, therefore, be provided from diet. Transgenic oilseeds accumulating LCPUFA represent an attractive sustainable source to support human nutrition. Generation of these transgenic lines should be achieved by cloning the gene encoding for lysophosphatidic acid transferase (LPAAT), an enzyme that specifically introduces LCPUFA to the second position of the glycerol backbone in seed oils. Analysis of lipidic composition of different organisms led to the identification of two relevant strains; the bacterium S. handedai and the eukaryotic microorganism Thraustochytrium. A comparative enzymatic analysis of membrane fractions from both organisms showed that LPAAT from S. hanedai was more active on C20-and C22-fatty acids, whereas Thraustochytrium-LPAAT had a preference for C22-fatty acid. To clone the LCPUFA-specific LPAAT genes, genomic libraries from S. hanedai and cDNA expression libraries from Thraustochytrium were constructed and screened. Gene sequences from both organisms were identified and compared to the gene bank database. Both gene sequences displayed high homology to bacterial LPAATs. Functional S. hanedai-LPAAT enzyme showing pronounced specificity to LCPUFAs was successfully expressed in E. coli. Considering the sequence similarity between the two genes, it was assumed that Thraustochytrium-LPAAT enzyme would display similar specificity, but unlike S. hanedai-LPAAT enzyme production of Thraustochytrium-LPAAT in E. coli and S. cerevisiae proved to be difficult since expression levels were below detection limits and no enzymatic activity could be measured. The expression levels were improved by fusing the LPAAT gene to glutathione-S-transferase (GST). However the fusion partner prevented the formation of catalytically active conformation of the enzyme leading to production of inactive protein. Expression studies carried out in different organisms, insect cells were found out to be best suited for the expression of Thraustochytrium-LPAAT gene.

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