Characterization of plant tocopherol cyclases

Kumar, Rajeev; Frentzen, Margarete

doi:1240

Characterization of plant tocopherol cyclases

Kumar, Rajeev (Author)

2005

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Rajeev Kumar

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2005

UmfangVIII, 88 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2005

Zsfassung in dt. und engl. Sprache

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Frentzen, Margarete (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2005-06-09

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-12408
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/59997/files/Kumar_Rajeev.pdf

Einrichtungen

Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften (100000)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Biowissenschaften, Biologie (frei) ; tocopherols (frei) ; tocopherol cyclase (frei) ; vitamine E (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Die als Vitamin E bekannten Tocopherole sind amphipathische Moleküle, die aus einer polaren Chromanol-Kopfgruppe und einer lipophilen Isoprenoid-Seitenkette aufgebaut sind. Als Nahrungsergänzungsmittel spielen sie vermutlich eine wichtige Rolle bei der Verbesserung der Immunfunktion und begrenzen sowohl das Auftreten als auch den Verlauf einiger degenerativer Krankheiten. Tocopherole werden nur in photosynthetischen Organismen synthetisiert. In Pflanzen verläuft die Tocopherol-Biosynthese an der inneren Envelope-Membran der Chloroplasten. Hierbei katalysiert die Tocopherol-Cyclase (TC) als ein Schlüsselenzym die Biosynthese des Chromanol-Ringsystems der verschiedenen Vitamin E-Isoformen. Um die Funktion der TC in der Tocopherol-Biosynthese aufzuklären, wurden im Rahmen dieser Arbeit die TC Gene aus Arabidopsis und Mais kloniert, charakterisiert und für funktionale Expressionsstudien in E. coli verwendet. Die Expressionsbedingungen wurden optimiert, um eine möglichst hohe Akkumulation der rekombinanten, in ihrer momomeren Form katalytisch aktiven löslichen TC-Proteine in dem bakteriellen Expressionssystem zu erreichen. Mittels Affinitätschromatographie angereicherte rekombinante TC-Proteinfraktionen wurden für die Analyse der enzymatischen Eigenschaften eingesetzt. Diese Experimente zeigten, dass die funktional orthologen Proteine aus Arabidopsis und Mais in ihren enzymatischen Eigenschaften voneinander abweichen und deutliche Unterschiede im pH- und Temperatur-Optimum sowie in ihren kinetischen Konstanten aufweisen. Um neue Einblicke in die Mechanismen zu erhalten, die die Tocopherol-Biosynthese regulieren, wurden chimäre TC-Genkonstrukte in den Samen transgener Rapspflanzen exprimiert. Die Überexpression der rekombinanten TC-Proteine bewirkte einen deutlichen Anstieg des Gesamt-Tocopherolgehaltes in den Samen und deutete daraufhin, dass die TC-Aktivität einer der limitierenden Faktoren in der Tocopherol-Biosynthese ist. Darüber hinaus wurde durch die Überexpression der rekombinanten TCs in den reifenden Samen transgener Brassica napus-Pflanzen der Plastochromanol-8-Gehalt um ein Mehrfaches gesteigert. Diese Daten zeigten, dass die TCs aus Arabidopsis und Mais eine wenig ausgeprägte Substratspezifität besitzen und auch Plastochinon-9 zu Plastochromanol-8 zyklisieren können, und lieferten weiterhin Beweise für eine regulatorische Funktion der TCs im Prenyllipid-Stoffwechsel.

Tocopherols, collectively known as vitamin E, are amphiphatic molecules consisting of a polar chromanol head ring and a lipophilic isoprenoid tail. Because of the diverse functions, dietary supplements of tocopherols are thought to play an important role in improving immune function and in limiting the incidence and progression of several degenerative human diseases. Tocopherols are synthesized only in photosynthetic organisms. In plants, tocopherol biosynthesis proceeds at the inner envelope membrane of plastids. In the tocopherol biosynthetic pathway, tocopherol cyclase (TC) catalyses the key step in the biosynthesis of the chromanol substructure of the vitamin E family. To investigate the role of TC in the tocopherol biosynthesis, the present study was aimed at cloning and characterization of the TC genes from Arabidopsis and maize. The TC genes from Arabidopsis and maize were engineered for functional expression studies in E. coli. Firstly, the expression conditions were optimized to achieve the accumulation of high levels of recombinant TC proteins in the bacterial host cells. Subsequently the recombinant TC proteins, which behaved like soluble proteins and were catalytically active in their monomeric forms, were purified by affinity chromatography and used for the analysis of their enzymatic properties. These experiments revealed that the functional orthologs from the two plant species possess remarkable differences in their enzymatic properties with respect to pH and temperature optima and their kinetic constant. To gain new insights into the mechanisms regulating the tocopherol biosynthesis, chimeric TC gene constructs were overexpressed in developing seeds of transgenic rapeseed plants. This TC overexpression resulted in a significant increase in total tocopherol content, suggesting that TC activity is the limiting factor of tocopherol biosynthesis. Furthermore, overexpression of the recombinant TCs in developing seeds of Brassica napus enhanced the plastochromanol-8 content several folds. These findings show that TCs from Arabidopsis and maize possess a broad substrate specificity and can cyclize plastoquinone-9 to plastochromanol-8. In addition, they provided evidence for a regulatory function of the TC in prenyllipid metabolism.

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