Charakterisierung der Proteinkinase DYRK1A : Substrat- und Autophosphorylierung

Himpel, Sunke; Becker, Walter

doi:urn:nbn:de:hbz:82-opus-13853

Charakterisierung der Proteinkinase DYRK1A : Substrat- und Autophosphorylierung = Characterisation of the protein kinase DYRK1A : Substrates and Autophosphorylation

Himpel, Sunke (Author)

2005

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Sunke Himpel

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2005

UmfangIX, 122 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss.

Genehmigende Fakultät
Fak10

Hauptberichter/Gutachter
Becker, Walter (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2005-09-27

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-13853
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/60083/files/Himpel_Sunke.pdf

Einrichtungen

Medizinische Fakultät (510000-1)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Medizin (frei) ; Protein-Serin-Threonin-Kinasen (frei) ; Protein-Tyrosin-Kinasen (frei) ; MAP-Kinase (frei) ; Down-Syndrom (frei) ; Dyrk1A (frei) ; Histon H3/rekombinantes protein (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 610

Kurzfassung
Dual Specificity YAK1p-Related Kinase1A (DYRK1A) kodiert für eine evolutionär hoch konservierte Proteinkinase, die aufgrund von Beobachtungen an verschiedenen Tiermodellen und der genomischen Lokalisation auf Chromosom 21 beim Menschen als Kandidatengen der mentalen Retardierung beim DOWN-Syndrom angesehen wird. Auf zellulärer Ebene ist noch sehr wenig über die Funktion von DYRK1A bekannt, auch wenn Vergleiche mit näher verwandten Kinasen und die Beobachtung, dass es sich um eine nukleare Kinase handelt, nahe legen, dass DYRK1A in die Regulation von Zellteilung und -differenzierung involviert sein könnte. Eine der Möglichkeiten, weitere Aufschlüsse über die molekulare Funktion einer Proteinkinase zu bekommen, ist die biochemische Charakterisierung der Phosphorylierungsreaktion. DYRK1A zeigt sowohl Auto- als auch Substratphosphorylierungsaktivität, wobei sich die Autophosphorylierung sowohl auf Serin/Threonin als auch auf Tyrosin bezieht, wohingegen bei Substraten bis jetzt nur die Phosphorylierung von Serin/Threonin beobachtet wurde. Ausgehend von Ergebnissen, die die Autophosphorylierung in der N-terminalen extrakatalytischen Domäne vermuten ließen, wurde die Phosphorylierung von Tyrosinresten innerhalb dieser Domäne weiter untersucht. Hierbei zeigte sich, dass DYRK1A nach bakterieller Expression an Tyrosin-111 autophosphoryliert ist, wobei Tyrosin-104 offensichtlich für die Phosphorylierung notwendig ist. In vitro Phosphorylierungsuntersuchungen zeigten keinen Einfluss von Tyrosin-111 oder -104 auf die enzymatische Aktivität von DYRK1A. Auffällig ist jedoch, dass Tyrosin-111 sich innerhalb einer Erkennungssequenz für PTB-Domänen befindet, so dass Tyrosin-111 an der Regulation der Interaktion zwischen DYRK1A und PTB-Domänen beteiligt sein könnte. Außerdem befindet sich Tyrosin-111 direkt N-terminal des zweiteiligen Kernlokalisationsmotives von DYRK1A, so dass die Phosphorylierung die subzelluläre Lokalisation von DYRK1A beeinflussen könnte. Um die Funktion von Tyrosin-111 und dessen Phosphorylierung weiter klären zu können, sind jedoch zusätzliche Untersuchungen notwendig. DYRK1A phosphoryliert spezifisch eine Reihe von in vitro Substraten. Eines der Substrate ist Histon H3, das häufig als Substrat von Proteinkinasen eingesetzt wird. Um die Phosphorylierung von Histon H3 durch DYRK1A weiter charakterisieren zu können, wurde eine neue Methode entwickelt, Histon H3 rekombinant herzustellen. Hierdurch wurde eine Homogenität von ungefähr 95% erreicht. Die Proteinsequenzierung zeigte bis auf die Abspaltung des N-terminale Methionins keine posttranslationalen Modifikationen des rekombinanten Histon H3. Demnach wurde eine Methode entwickelt, die es erlaubt in relativ kurzer Zeit große Mengen an homogenem Histon H3 zu gewinnen, das als ein optimales Substrat in Phos-phorylierungsreaktionen mit Proteinkinasen eingesetzt werden kann. Die Untersuchungen zur Phosphorylierung des rekombinanten Histon H3 durch DYRK1A ergaben, dass es sich bei Threonin-45 um die Akzeptoraminosäure in Histon H3 handelt. Ein aus der N- und C-terminalen Sequenz um Threonin-45 hergeleitetes Oligopeptid (H338-52) wurde effizient durch DYRK1A phosphoryliert, so dass man davon ausgehen konnte, dass es das für DYRK1A notwendige Erkennungsmotiv enthielt. Innerhalb von H338-52 befanden sich an strukturell markanten Aminosäuren vor allem ein Arginin- und ein Prolinrest N-terminal des phosphorylierten Threoninrestes. An diese Arbeit anschließende Untersuchungen bestätigten den Einfluss dieser beiden Aminosäuren und zeigten zudem, dass ein direkt C-terminaler Prolinrest die Effizienz der Phosphorylierung noch weiter steigern kann. Somit wurde DYRK1A in Analogie zu anderen verwandten Kinasen der CMGC-Gruppe als Prolin-gelenkte Proteinkinase entdeckt. Die effiziente Phosphorylierung von Serin/ Threoninresten, denen drei Aminosäuren N-terminal ein Argininrest vorangeht, ist dahingegen innerhalb der CMGC-Gruppe typisch für die Familie der DYRK-Kinasen.

The Dual Specificity YAK1p-Related Kinase1A (DYRK1A) encodes an evolutionary highly conserved protein kinase. Due to different animal models and its genomic localisation on human chromosome 21, is it considered a candidate gene in mental retardation of the Down-syndrome. Little was known about the cellular function of DYRK1A, but comparison with related kinases and its nuclear localisation gave evidence for its regulatory involvement in mitosis and cell differentiation. Studying the catalysed reactions of phosphorylation is one way to get more information about the molecular function of protein kinases. DYRK1A phosphorylates substrates on serine/threonine residues, whereas autophosphorylation of serine/threonine residues as well as of tyrosine residues is possible. Due to former results, DYRK1A seemed to autophosphorylate its N-terminal segment. Thus, one topic of this work was to study the autophosphorylation of the N-terminal segment. After recombinant expression in bacteria DYRK1A could be shown to be autophosphorylated on tyrosine-111, whereas tyrosine-104 seemed to be involved in this phosphorylation. Mutation analysis of both residues showed no effect on its enzymatic activity in vitro. It is noticeable that tyrosine-111 lies within a possible recognition site of PTB-domains. Thus, tyrosine-111 could be involved in the control of interactions between DYRK1A and PTB-domains of other proteins. In addition tyrosine-111 lies just N-terminal of a biparted nuclear localisation sequence of DYRK1A and thus, involvement in the subcellular localisation of DYRK1A can be hypothesized. DYRK1A specifically phosphorylates a couple of protein substrates in vitro. One of them is histone H3, a typical substrate of in vitro phosphorylation reactions. The second topic of this work was to do further study this phosphorylation reaction. First, a new method to produces pure and unmodified recombinant histone H3 was developed. Homogeneity was 95%. Protein sequencing detected no posttranslational modifications except N-terminal cleavage of the first methionine. In-vitro phosphorylation reactions showed that recombinant Histone H3 is specifically phosphorylated on threonine-45 by DYRK1A. The synthetic oligopeptide H338-52 around threonine-45 was shown to be an efficient substrate of DYRK1A. Two remarkable residues lie within this sequence, namely an arginine and a proline, which might be considered to be part of the recognition sequence of DYRK1A substrates. This could be confirmed by mutation analysis, which moreover showed that inserting a proline directly N-terminal of the acceptor residue further increases the efficiency of substrate phosphorylation. Proline-directed substrate phosphorylation can also be seen in other related kinases of the CMGC-group, whereas an additional arginine within the recognition sequence of substrates is a typical feature of kinases of the DYRK-family.

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