Biochemische und molekularbiologische Untersuchungen zur Beteiligung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) am Wirkungsmechanismus der systemisch erworbenen Resistenz (SAR) in Arabidopsis thaliana (L.) Heynh

Kiefer, Ingrid; Slusarenko, Alan

doi:26421

Biochemische und molekularbiologische Untersuchungen zur Beteiligung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) am Wirkungsmechanismus der systemisch erworbenen Resistenz (SAR) in Arabidopsis thaliana (L.) Heynh

Kiefer, Ingrid

2005

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Ingrid Kiefer

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2005

Umfang208 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2005

Zsfassung in dt. und engl. Sprache

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Slusarenko, Alan (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2004-11-23

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-20050808
DOI: 10.18154/RWTH-CONV-122165
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/60454/files/60454.pdf

Einrichtungen

Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften (100000)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Ackerschmalwand (Genormte SW) ; Induzierte Resistenz (Genormte SW) ; Reaktive Sauerstoffspezies (Genormte SW) ; Molekularbiologie (Genormte SW) ; Pflanzen (Botanik) (frei) ; ROS (frei) ; NO (frei) ; SAR (frei) ; ARABIDOPSIS (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 580

Kurzfassung
Die Induktion der systemischen Resistenz (SAR) kann in Arabidopsis Pflanzen durch biologische und chemische Aktivatoren erzielt werden. Diese erworbene Resistenz manifestiert sich durch pflanzliche Reaktionen, die einer hypersensitiven Reaktion (HR) ähneln, und sie korreliert mit einer erhöhten Expression sogenannter PR Gene, die für „pathogenesis-related proteins“ kodieren. Ebenfalls wird die SAR von einer lokalen und systemischen Akkumulation der Salicylsäure (SA) begleitet. Durch die Applikation von SA kann in der Pflanze Resistenz gegen Pathogene induziert werden. Dabei dient die SA der Pflanze auch als wichtiges endogenes Signal-molekül, welches für die Ausprägung der SAR essentiell ist. Die weiteren Faktoren, die hierzu beitragen, sind noch weitgehend unbekannt oder umstritten. Letzteres gilt insbesondere für die Funktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS). Die hier dar-gestellten Untersuchungen widmen sich der Frage, ob bzw. inwiefern die ver-schiedenen ROS an der Ausbildung der biologisch und der chemisch induzierten Resistenz in Arabidopsis beteiligt sind. Es wurden verschiedene Testsysteme zur Induktion der SAR etabliert. Als Marker dienten neben der Messung des SA-Gehaltes die Expression der PR Gene und der Infektionsverlauf einer Folgeinfektion. Wenn ROS in ausreichenden Mengen während der SAR Induktion lokal oder systemisch gebildet werden, könnte eine Detektion möglich sein. Die Akkumulation von H2O2 war nach der Behandlung von Pflanzen mit PsmDC3000/avrRpm1 in lokalen, nicht jedoch in systemischen Blättern nachweisbar. O2.- konnte nur lokal nach einer Verwundung beobachtet werden. Wenn ROS, die am Ort der Primärinfektion gebildet werden, an der SAR beteiligt sein sollten, dann sollte durch die Applikation von ROS bzw. ROS-generierenden (oder NO-generierenden) Enzymsystemen Resistenz in systemischen Blättern gegenüber Pathogenen erzeugt werden können. Zudem sollte die Akkumulation der molekularen Marker der Resistenz (SA, PR mRNA) zu beobachten sein. Es konnte jedoch kein zum biologisch oder chemisch induzierten SAR-Zustand vergleichbarer Resistenzzustand der Pflanzen erreicht werden. Wenn ROS, die am Ort der Primärinfektion gebildet werden, an der SAR beteiligt sein sollten, dann sollte die Applikation von Inhibitoren bzw. Behandlungen, die den Stoffwechsel der ROS beeinflussen, zu messbaren Änderungen der SAR-Ausprägung oder zu einer Reduzierung der SAR-Marker führen. Kandidaten für die Bildung von ROS sind die in der Plasmamembran lokalisierte NAD(P)H-Oxidase, zellwandgebundene Peroxidasen oder die Xanthinoxidase (XO). Es wurden die Auswirkungen von DPI (Inhibitor der NAD(P)H-Oxidase), Allopurinol (Inhibitor der XO), Katalase (Abbau von H2O2) und auch die Auswirkungen des NO-„scavengers“ Carboxy-PTIO-Kalium untersucht. Es konnte jedoch keine signifikante Reduzierung des SA-Gehaltes bzw. der PR mRNA-Akkumulation oder ein Einfluss auf die Ausprägung der SAR festgestellt werden. Die mögliche Rolle von intrazellulär gebildetem O2.- wurde auch mittels transgener Pflanzen untersucht. Hierzu wurde die Etablierung der SAR in Superoxiddismutase (cyt. Cu,Zn-SOD) Überexpressions- bzw. antisense / sense Suppressionslinien analysiert. Es wurden jedoch keine SAR-relevanten Phänotypen gefunden. Unabhängig von der Natur des systemischen Signals, welches für die Ausbildung der SAR erforderlich ist, wurde der Signaltransportweg betrachtet. Hierzu wurden die Muster des systemischen Assimilattransportes aus dem infizierten Blatt in die übrigen Teile der Pflanze mit dem Muster der SAR-Induktion und dem Muster der SAR-Marker-Akkumulation verglichen. Anhand der Ergebnisse wird die lokale und systemische Beteiligung von ROS an der Ausprägung der SAR in Arabidopsis diskutiert.

Systemic Acquired Resistance (SAR) can be conditioned in Arabidopsis by chemical and biological activators. This acquired resistance to a subsequent infection manifests itself as a phenocopy of the Hypersensitive Reaction (HR) and is correlated with an increased expression of so-called PR genes, which code for "pathogenesis related" proteins. SAR is also accompanied by a local and systemic accumulation of salicylic acid (SA). Treatment of plants with SA can also induce SAR against a broad spectrum of pathogens. SA serves as an important local signal substance which is essential for the conditioning of the SAR state. Further factors which might contribute to signalling in establishing the SAR state are either unknown or their role is controversial. The latter applies particular to the role of reactive oxygen species (ROS) in local and systemic signals. The work described in this thesis addresses the question of the role that various ROS play in establishing biologically and chemically induced SAR. In the first phase various test systems for the induction of SAR in Arabidopsis were established. SA accumulation as well as PR gene expression and the course of challenge inoculation were used as markers for the SAR state. If ROS accumulate either locally or systemically during SAR induction it could be possible to detect them. Therefore, various ROS were tested for. H2O2 accumulated locally but not systemically after inoculation with PmsDC3000/avrRpm1. O2.- was only detected locally after wounding. If ROS produced at the site of inoculation are involved in conditioning SAR, then treatment with ROS or ROS-generating systems might lead to the induction of resistance in systemic leaves, and / or the accumulation of molecular markers for SAR (PR mRNA, SA). To test this possibility, leaves were treated with H2O2, paraquat (in light -O2.-), H2O2-generating, O2.-generating and NO-generating enzyme systems. However, none of the treatments gave results comparable to biological or chemically induced SAR in the controls. If ROS produced at the site of inoculation are involved in conditioning SAR, then the application of inhibitors or treatments which affect ROS metabolism might lead to measurable changes in the SAR response. Candidates for ROS synthesis are the plasmamembrane NAD(P)H oxidase, cell wall peroxidases or xanthine oxidase (XO). If O2.- produced by NAD(P)H oxidase is involved in the SAR, its inhibition by DPI might be expected to lead to a reduction in SAR or its molecular markers. Similar, if O2.- is produced via XO activity, allopurinol (a XO inhibitor) treatment might be expected to lead to a reduction SAR marker accumulation and / or SAR itself. If there is H2O2 involved in conditioning SAR, then its destruction via infiltrated catalase might be expected to lead to a reduction in SAR markers. Additionally, the effects of the NO scavenger Carboxy-PTIO-potassium on SAR induction was investigated. In summary it can be said that, neither DPI nor catalase, allopurinol and Carboxy-PTIO-potassium led to a significant reduction in SA or PR transcript accumulation in either the inoculated or the systemic leaves. No significant effect on the conditioning of SAR was detected as the histological level either (challenge inoculation). The possible role of intracellular O2.- production was investigated using transgenic plants over- or under expressing (sense / antisense) a cytosolic superoxide dismutase (SOD). However, no SAR relevant phenotypes were observed. Independent of the nature of the systemic signal which leads to the conditioning of SAR throughout the plant, the pathway of signal transport was investigated. To address this aspect the pattern of assimilate transport out of an inoculated leaf into the rest of the plant was compared to the pattern induction of SAR and SAR molecular markers. The results are discussed in terms of the possible role of ROS in local and systemic signalling in Arabidopsis during the establishment of SAR.

OpenAccess:
PDF
(additional files)