Rekombinante Herstellung und Charakterisierung phenoloxidierender Enzyme aus Geobacillus stearothermophilus zur Evaluierung einer biosensorischen Anwendung

Jäntges, Uwe Konrad; Hartmeier, Winfried

doi:HT014867025

Rekombinante Herstellung und Charakterisierung phenoloxidierender Enzyme aus Geobacillus stearothermophilus zur Evaluierung einer biosensorischen Anwendung = Recombinant production and characterisation of phenol oxidising enzymes from Geobacillus stearothermophilus for the evaluation of a biosensor application

Jäntges, Uwe Konrad (Author)

2006

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Uwe Konrad Jäntges

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2006

UmfangIII, 122 S. : graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2006

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Hartmeier, Winfried (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2006-02-10

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-16140
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/61367/files/Jaentges_Uwe.pdf

Einrichtungen

Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften (100000)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Biowissenschaften, Biologie (frei) ; Enzym-Biosensor (frei) ; Phenol (frei) ; Heterologe Genexpression (frei) ; Phenolhydroxlase (frei) ; Tandemexpression (frei) ; Immobilisierung (frei) ; phenol hydroxylase (frei) ; tandem expression (frei) ; immobilisation (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
In der vorliegenden Arbeit wurde die Organisation der Phenolhydroxylase aus Geobacillus stearothermophilus auf genetischer Ebene genauer aufgeklärt. Es wurden die Einzelkomponenten Phe A1 (Oxygenase-Komponente), Phe A2 (Flavin-Reduktase-Komponente) und ein Tandemkonstrukt aus beiden Komponenten rekombinant mit einem E.coli-Expressionsstamm produziert. Durch das Einfügen eines Hexahistidin-tags konnten alle Enzyme erstmals bis zur Homogenität aufgereinigt werden. Die Phe A2-Komponente konnte nach Optimierung der Expression mit einer maximalen spezifischen Aktivität von 0,6 U mg 1 hergestellt werden. Durch die Tandemexpression konnte der Phenolhydroxylase-Komplex über eine Affinitätsaufreinigung bis zur Homogenität aufgereinigt werden. Der Komplex benötigte aufgrund des direkten Elektronentransfers kein gelöstes FAD mehr. Für die in der vorliegenden Arbeit gewonnene thermophile Phenolhydroxylase konnte die bisher höchste in der Literatur beschriebene Aktivität mit 0,62 U mg-1 erzielt werden. Die Charakterisierung des Phenolhydroxylase-Komplexes ergab ein Temperaturoptimum von 56,5°C, eine Aktivierungs- bzw. Inaktivierungsenergie von 44,6 kJ mol 1 bzw. 260 kJ mol 1. Der optimale pH-Wert lag bei 7,8. Die kinetischen Daten wurden mit Phenol und FAD als Elektronenakzeptoren berechnet. Die KM-Werte betrugen 138 µM für Phenol und 34,6 µM für FAD. Erstmals konnte der genaue Reaktionsmechanismus der Phenolhydroxylase aus G. stearothermophilus aufgeklärt werden. Untersuchungen zur Organisation und Interaktion führten zu dem Ergebnis, dass es sich bei der vorliegenden Phenolhydroxylase, entgegen des derzeitigen Wissensstandes, um ein Zweikomponenten-Enzym handelt, das aus einer Phe A1- und zwei Phe A2-Komponenten besteht. Letztendlich konnte mit dem rekombinanten Phenolhydroxylase-Komplex der Beweis zur biosensorischen Verwendbarkeit erbracht werden. Durch die Immobilisierung in eine Acrylamidmatrix mit anschließender Kopplung an ein optisches Sauerstoffmessgerät konnte ein stabiler Phenolbiosensor mit einem linearen Messbereich von 0,6 bis 56,5 µM hergestellt werden.

In the current thesis the genetic structure of the phenol hydroxylase of Geobacillus stearothermophilus has been clarified. The single components Phe A1 (oxygenase component), Phe A2 (Flavin reductase component) and a tandem construct consisting of both components were successfully produced with an E. coli host strain. Due to hexahistidin residue, with which all components were provided, all enzymes could be expressed and purified to homogeneity for the first time. The highest specific activity for the Phe A2 component achieved after optimisation was 0,6 U mg-1. The phenol hydroxylase complex was purified to homogeneity. For the oxidation of substrates no soluble FAD was needed due to direct transfer of electrons between the components. A specific activity of 0,62 U mg-1 was achieved for the phenol hydroxylase. This is the highest described value for thermostable phenol hydroxylases. The characterisation of the enzyme complex showed the following results, the temperature optimum was 56,5°C, the activation energy was 44,6 kJ mol-1 and the inactivation energy was 260 kJ mol-1. The optimal pH Value was about 7,8. The kinetic data was measured and calculated for phenol and FAD as electron acceptors. The Km values were 138 µM for phenol and 34,6 µM for FAD. For the first time the reaction mechanism of the phenol hydroxylase was well investigated. Testing showed that phenol hydroxylase from Geobacillus stearothermophilus in contrast to the current opinion in science consists of two subunits. On is the Phe A1 component and the second is a dimmer of Phe A2 subunits. At the end it was successfully proven that the recombinant phenol hydroxylase complex is suitable for biosensor applications. The enzyme complex was immobilised into an acrylamide matrix and coupled to an optical oxygen detector. This setup formed a stable biosensor for phenolic compounds with a linear measurement range from 0,6 to 56,5 µM.

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