Anaerobic degradation of steroid hormones by novel denitrifying bacteria

Fahrbach, Michael; Hollender, Juliane

doi:HT014969379

Anaerobic degradation of steroid hormones by novel denitrifying bacteria = Anaerober Abbau von Steroidhormonen durch neuartige denitrifizierende Bakterien

Fahrbach, Michael (Author)

2007

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Michael Fahrbach

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2007

Umfang115 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2006

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Hollender, Juliane (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2006-12-12

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-17491
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/61616/files/Fahrbach_Michael.pdf

Einrichtungen

Lehrstuhl für Hygiene und Umweltmedizin (521000-2)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Biowissenschaften, Biologie (frei) ; Estradiol (frei) ; Testosteron (frei) ; Mikrobieller Abbau (frei) ; Bakterien (frei) ; Denitrifikation (frei) ; Anaerober Abbau (frei) ; Steroidhormone (frei) ; denitrifizierende Bakterien (frei) ; Anaerobic degradation (frei) ; denitrifying bacteria (frei) ; estradiol (frei) ; testosterone (frei) ; steroid hormones (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Während des letzten Jahrzehnts wurde die Wirkung von Steroidhormonen aus natürlichen und anthropogenen Quellen auf Mensch und Tier als ein Risiko für deren Fortpflanzungsfähigkeit erkannt. Diese negativen ökologischen Effekte haben zu einem vermehrten Interesse an der Abbaubarkeit dieser Verbindungen im Boden, in Sedimenten und während des Abwasserreinigungsprozesses geführt. Analysen von Steroidhormonen haben gezeigt, dass die Denitrifikation signifikant zur Gesamtelimination von Estradiol im Abwasserreinigungsprozess beitragen kann. Jedoch ist nichts über die Bakterien bekannt, welche für diesen Estradiolabbau verantwortlich sind. Auch über den Abbau von Testosteron unter anoxischen Bedingungen liegen bisher keine Informationen vor. Diese Arbeit liefert erste Daten über den anaeroben Abbau von Estradiol und Testosteron durch neuartige denitrifizierende Bakterien. Es wurden zwei Bakterien (Stamm AcBE2-1 und Stamm FS) mit Estradiol oder Testosteron als einziger Energie- und Kohlenstoffquelle aus Belebt- und Faulschlamm einer kommunalen Kläranlage isoliert. Stamm AcBE2-1 wurde mit Estradiol und Nitrat aus Belebtschlamm isoliert. Dieses Bakterium oxidierte Estradiol über Estron vollständig zu Kohlendioxid und Wasser und reduzierte Nitrat zu einer Mischung aus Distickstoffmonoxid und molekularem Stickstoff. Während des Wachstums wurde Nitrit akkumuliert. Unter Berücksichtigung von assimiliertem Estradiol lag die Elektronenbilanz zwischen 90 und 100%. Das Bakterium konnte mit Nitrat als Elektronenakzeptor auch Estron, Fettsäuren (C2 bis C6), Isobutyrat, Crotonat, DL-Lactat oder mehrere Intermediate des Tricarbonsäurezyklus als Energiequelle nutzen. Eine phylogenetische Analyse der Gensequenz der 16S rRNA ergab, dass Stamm AcBE2-1 eine eigene Abstammungslinie in der Familie Rhodocyclaceae innerhalb der Betaproteobacteria darstellt. Stamm AcBE2-1 bildet zusammen mit mehreren Klonsequenzen von bisher nicht kultivierten Bakterien ein neues Cluster neben den bekannten Abstammungslinien. Die nächsten Verwandten mit einer Sequenzähnlichkeit von <93,9% sind die Cholesterol-abbauenden Denitrifizierer Sterolibacterium denitrificans DSM 13999 und Stamm 72Chol (= DSM 12783). Der G+C Gehalt der DNA betrug 61,4 mol%. Der Nachweis von Ubichinon Q-8 und ein Fettsäuremuster, welches sich deutlich von dem von Sterolibacterium denitrificans unterschied, untermauern die Ergebnisse der phylogenetischen Analyse. Aufgrund der Sequenzdaten des 16S rRNA Gens, gemeinsam mit chemotaxonomischen und physiologischen Daten, lässt sich Stamm AcBE2-1 (= DSM 16959 = JCM 12830) in einer neuen Gattung Denitratisoma gen. nov. als der Typstamm der Typspezies Denitratisoma oestradiolicum gen. nov., sp. nov. einordnen. Der denitrifizierende Stamm FS wurde mit Estradiol und Testosteron aus Faulschlamm isoliert. Stamm FS ist das erste Bakterium, welches sowohl Estradiol (C18) als auch Testosteron (C19) anaerob mineralisieren kann. Die Abbaubilanz zeigte in Testosteron-limitierten Kulturen eine vollständige Oxidation zu Kohlendioxid und Wasser. Eine nahezu vollständige Oxidation von Estradiol wurde auch in Nitrat-limitierten Kulturen festgestellt. Estron und 4-Androsten-3,17-dion wurden als Zwischenprodukte des Estradiol- bzw. Testosteronabbaus identifiziert. Distickstoffmonoxid ist das einzige Endprodukt der Denitrifikation. Es wurde keine Nitritakkumulation während des Wachstums festgestellt. Neben Estradiol und Testosteron wurde nur ein enges Spektrum organischer Substrate als Elektronendonoren unter denitrifizierenden Bedingungen genutzt. Das Bakterium konnte mit Nitrat als Elektronenakzeptor auch Estron, 4-Androsten-3,17-dion, Acetat, Propionat, Isobutyrat, Valerat, Caproat, Heptanoat oder Glutamat als Substrate nutzen. Vergleiche der Gensequenz der 16S rRNA ergaben, dass Stamm FS keine unmittelbaren Verwandten besitzt und somit eine eigene Abstammungslinie zwischen Klonsequenzen von bisher nicht kultivierten Bakterien innerhalb der Gammaproteobacteria darstellt. Eine entfernte Verwandtschaft von Stamm FS besteht zu den Gattungen Nevskia, Hydrocarboniphaga, Nitrosococcus, und Ectothiorhodospira (etwa 87,1% Sequenzähnlichkeit des 16S rRNA Gens). Der G+C Gehalt der DNA betrug 61,9 mol%. Aufgrund des hohen Sequenzunterschiedes des 16S rRNA Gens und der verschiedenartigen physiologischen Eigenschaften zu bisher beschriebenen Arten, wurde gemeinsam mit chemotaxonomischen Daten gezeigt, dass Stamm FS (= DSM 18526) als Typstamm einer Typspezies in einer neuen Gattung Steroidobacter gen. nov. eingeordnet werden kann, für welche der Name Steroidobacter denitrificans gen. nov., sp. nov. vorgeschlagen wurde. Eine Proteomanalyse von Denitratisoma oestradiolicum zeigte die Induzierbarkeit Estradiol-spezifischer Proteine und führte zur Identifizierung mehrerer Enzyme wie zum Beispiel der S-Adenosylmethionin Synthase, S-Adenosylmethionin-abhängiger Methyltransferasen, der 3-Polyprenyl-4-hydroxybenzoat Carboxylase und mehrerer Hydroxysteroid-Dehydrogenasen, welche am anaeroben Estradiolabbau beteiligt sein könnten. Diese ersten Ergebnisse stellen die Vorraussetzung für eine detaillierte Charakterisierung und Aufklärung des Abbauweges von Estradiol durch dieses neuartige denitrifizierende Bakterium dar. Die erhaltenen Aminosäuresequenzen könnten in zukünftigen Untersuchungen verwendet werden, um degenerierte Oligonucleotide zur Klonierung und Sequenzierung der jeweiligen codierenden Gene herzustellen. Die kompletten Gensequenzen erlauben dann funktionelle und strukturelle Vergleiche zu verwandten Proteinen.

During the last decade, the endocrine disrupting activity of steroid hormones both of natural and of anthropogenic origin was recognized as a potential risk to the fertility of wildlife populations in various ecosystems and the human population. Concerns about potential negative ecological effects of steroid hormones have resulted in an increased interest with regard to the elimination of these compounds in soil, sediments, and during wastewater treatment. Analysis of steroid hormones showed that denitrification significantly contributes to the overall elimination of estradiol in the sewage sludge process. However, nothing is known about the bacteria responsible for this estradiol degradation. Also no information exists about the degradation of testosterone under anoxic conditions. This work gives first data about the anaerobic degradation of both estradiol or testosterone by novel denitrifying bacteria. These bacteria (strain AcBE2-1 and strain FS) were isolated in this work from activated sludge and anoxic digested sludge of a municipal wastewater treatment plant with estradiol or testosterone as the sole source of carbon and energy and nitrate as the electron acceptor. Strain AcBE2-1 was isolated from activated sludge with estradiol and nitrate. This bacterium oxidized estradiol beyond estrone completely to carbon dioxide and water by reduction of nitrate to a mixture of dinitrogen monoxide and dinitrogen, with the intermediate accumulation of nitrite. Electron recoveries were between 90 and 100%, taking into account assimilated estradiol. With nitrate as the electron acceptor, the bacterium also grew on estrone, fatty acids (C2 to C6), isobutyrate, crotonate, DL-lactate, or several citric acid cycle intermediates. Phylogenetic analysis of its 16S rRNA gene sequence revealed that strain AcBE2-1 represents a separate line of descent within the family Rhodocyclaceae (Betaproteobacteria). Together with several clone sequences obtained from hitherto uncultivated bacteria, strain AcBE2-1 forms a novel cluster distinct from known lineages. The closest relatives are the cholesterol-degrading, denitrifying bacteria Sterolibacterium denitrificans DSM 13999T and strain 72Chol (= DSM 12783), with <93.9% sequence similarity. The G+C content of the DNA was 61.4 mol%. Detection of a quinone system with ubiquinone Q-8 as the predominant compound and a fatty acid profile that is clearly different from Sterolibacterium denitrificans, supported the results of the phylogenetic analysis. On the basis of 16S rRNA gene sequence data in combination with chemotaxonomic and physiological data, strain AcBE2-1 (= DSM 16959 = JCM 12830) is placed in a new genus Denitratisoma gen. nov. as the type strain of the type species Denitratisoma oestradiolicum gen. nov., sp. nov. Strain FS was isolated from anoxic digested sludge on estradiol and testosterone with nitrate as the electron acceptor. Strain FS represents the first bacterium that anaerobically mineralizes both estradiol (C18) or testosterone (C19). The degradation balance measured in testosterone-limited cultures indicated a complete oxidation to carbon dioxide and water. Estradiol oxidation was almost complete even in nitrate-limited cultures. Estrone and 4-androstene-3,17-dione were identified as intermediates of estradiol and testosterone degradation, respectively. Dinitrogen monoxide was the sole end product of denitrification, without intermediate nitrite formation. Beside estradiol and testosterone, only a narrow spectrum of organic substrates were used as electron donors under denitrifying conditions including estrone, 4-androstene-3,17-dione, acetate, propionate, isobutyrate, valerate, caproate, heptanoate, or glutamate. Comparative 16S rRNA gene sequence analysis revealed that strain FS has no known close relatives and represents a separate line of descent within the Gammaproteobacteria positioned among clone sequences of so far uncultivated bacteria. A distant relationship of about 87.1 % 16S rRNA gene sequence similarity exists to the genera Nevskia, Hydrocarboniphaga, Nitrosococcus, and Ectothiorhodospira, all of which exhibit different physiological properties in comparison with strain FS. The G+C content of the DNA was 61.9 mol%. Based on the high 16S rRNA gene sequence divergence and different physiological properties to previously described bacteria in combination with chemotaxonomic data, strain FS (= DSM 18526) was indicated as the type strain of a type species placed in a new genus Steroidobacter gen. nov., for which the name Steroidobacter denitrificans gen. nov., sp. nov. is proposed. A proteomic approach with Denitratisoma oestradiolicum allowed to demonstrate the induction of estradiol-specific proteins and resulted in the identification of several enzymes for example S-adenosylmethionine synthase, S-adenosylmethionine-dependent methyltransferases, 3-octaprenyl-4-hydroxybenzoate decarboxylase, and several hydroxysteroid dehydrogenases that might be involved in anaerobic estradiol degradation. These initial results represent a prerequisite for a detailed characterization and elucidation of the estradiol degradation pathway in this novel denitrifying bacterium. The obtained amino acid sequence data could be used in future studies to construct degenerated oligonucleotides for cloning and sequencing the respective genes coding for these proteins. The complete nucleotide sequence information will then allow to search for related proteins and to make functional and structural comparisons.

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