Bestimmung von 3-Nitrotyrosin im Liquor als Hinweis für nitrosativen Stress

Peters, Christina; Ramaekers, Vincent Thomas

doi:1792

Bestimmung von 3-Nitrotyrosin im Liquor als Hinweis für nitrosativen Stress = Determination of 3-Nitrotyrosine in cerebro spinal fluid as an indicator of nitrosative stress

Peters, Christina (Author)

2006

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Christina Peters

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2006

UmfangIII, 92 S. : graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2006

Genehmigende Fakultät
Fak10

Hauptberichter/Gutachter
Ramaekers, Vincent Thomas (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2006-10-17

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-17929
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/61711/files/Peters_Christina.pdf

Einrichtungen

Lehrstuhl für Allgemeine Pädiatrie (537500-2)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Medizin (frei) ; Liquor cerebrospinalis (frei) ; Peroxonitrite (frei) ; HPLC (frei) ; 3-Nitrotyrosin (frei) ; Nitrosativer Stress (frei) ; Elektrochemische Detektion (frei) ; 3-nitrotyrosine (frei) ; nitrosative stress (frei) ; electrochemical detection (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 610

Kurzfassung
Dieser Arbeit lag die Fragestellung zugrunde, ob bei Kindern mit verschiedenen neuro- logischen Erkrankungen nitrosativer Stress, vermittelt durch die Bildung von Peroxynitrit (ONOO-) eine Rolle spielt bzw. ursächlich sein kann. In der Literatur finden sich bereits zahlreiche Beispiele für neurologische Erkrankungen, die durch nitrosativen Stress verursacht oder zumindest beeinflusst zu werden scheinen, z.B. Alzheimer, ALS, Entzündungen, Multiple Sklerose usw. Daher wurde der Liquor von 40 Kindern und drei Erwachsenen (= 43 Patienten) mit verschiedenen neurologischen Erkrankungen sowie von 18 Kontrollkindern untersucht. Bei den 43 Patienten lagen verschiedene Erkrankungen vor, die auf die ein oder andere Weise durch eine erhöhte Entstehung von Peroxynitrit beeinflusst sein können. Um das Ausmaß der Peroxynitritbildung indirekt einschätzen zu können, wurde 3-NT gemessen, da Peroxynitrit ein sehr flüchtiger, instabiler Stoff ist. 3-NT kann als stabiler Marker für nitrosativen Stress und Bildung von Peroxynitrit angesehen werden, da es ein stabiles Produkt aus der Reaktion von Peroxynitrit mit Tyrosin darstellt. Als Untersuchungsmethode wurde die HPLC mit elektrochemischer Detektion gewählt. Diese stellte sich als Methode der Wahl dar, da mit ihr auch sehr kleine Mengen 3-NT nachgewiesen werden können. Außerdem ist diese Methode im Vergleich zu anderen , z.B. zur Massenspektroskopie, relativ kostengünstig, was für die Routinebestimmung von 3-NT von Vorteil ist. Es wurden zunächst einige Experimente durchgeführt, um zu zeigen, dass das Gerät exakt und linear arbeitet und um die Einflüsse verschiedener Parameter, z.B. pH-Wert des Puffersystems, darzustellen. Es folgte die Untersuchung der Liquorproben der Patienten- und der Kontrollgruppen. Von den 43 untersuchten Patienten zeigte sich jedoch nur bei acht eine deutliche Erhöhung von 3-NT. Desweiteren fanden sich bei einem Kind aus der Kontrollgruppe erhöhte 3-NT-Werte. Die 3-NT-Konzentration bei den 3-NT-positiven Proben lag im Durchschnitt bei 4,73 nM, in den anderen Proben konnte kein 3-NT nachgewiesen werden, d.h. die Konzentration lag bei 0 nM. Es stellt sich jedoch die Frage, warum bei nur acht der 43 Patienten eine 3-NT-Erhöhung nachgewiesen werden konnte. Von diesen acht Patienten waren drei Patienten Erwachsene, die an multipler Sklerose erkrankt waren. Die festgestellten 3-NT-Konzentrationen waren jedoch nicht so stark erhöht, wie in der Literatur, z.B. bei Alzheimer- oder ALS-Patienten, vorbeschrieben. Dies mag zum einen daran liegen, dass noch nie zuvor Kinder auf 3-NT untersucht worden sind, so dass für diese auch keine direkten Vegleichsmöglichkeiten in der Literatur bestehen. Evtl. wird aber im gesunden kindlichen Gehirn gar kein 3-NT produziert, so dass bei Kindern aus der Kontrollgruppe auch keines nachgewiesen werden konnte. Die in dieser Arbeit durchschnittlich detektierte 3-NT-Erhöhung auf 4,73 nM könnte darauf bezogen schon einen exzessiv erhöhten Wert darstellen. Ausserdem wurde nur freies, nicht in Protein gebundenes 3-NT bestimmt. Die in der Literatur beschriebenen 3-NT-Erhöhungen wurden allesamt in Liquorproben gefunden, in denen die Proteine zuvor hydrolysiert worden waren. Somit wurde auch in Proteinen gebundenes 3-NT miterfasst. Der Anteil von proteingebundenem 3-NT wurde in dieser Arbeit nicht mitbestimmt, daher fallen die ermittelten 3-NT-Konzentrationen natürlich niedriger aus. Desweiteren kann man bei der detektierten Substanz nicht mit letzter Sicherheit sagen, ob es sich tatsächlich um 3-NT handelt, und nicht um eine Fremdsubstanz, welche die gleiche Retentionszeit und ähnliche Retentionseigenschaften aufweist und daher mit 3-NT koeluiert. Dass es sich tatsächlich um 3-NT handelt, könnte man beweisen, indem man z.B. die eluierte Substanz auffängt und massenspektroskpisch untersucht. Abschließend bleibt also zu sagen, dass noch einige Fragen offen sind, welche weiterer Forschung bedürfen. Die Liquorproben der untersuchten Kinder, bzw. von Kindern mit ähnlichen neurologischen Erkrankungen sollten noch einmal nach Hydrolyse der Proteine auf 3-NT untersucht werden. Außerdem sollte die gefundene Substanz eindeutig als 3-NT identifiziert werden. Erst dann kann man die Ergebnisse wirklich mit den bereits in der Literatur veröffentlichen Daten vergleichen. Diese Arbeit soll daher nur als Anfang auf dem Gebiet der Forschung im Bereich „nitrosativer Stress bei Kindern mit neurologischen Erkrankungen“ begriffen werden, dem noch viele Studien folgen müssen. In diesem Sinne soll diese Arbeit eher als Methodenetablierung betrachtet werden, die Forschungsansätze aufzeigen soll.

Aim of this study was to find out whether nitrosative stress (via peroxynitrite(ONOO-)) plays a role or even causes various neurological diseases in children. In literature there have been several examples of neurological diseases which seem to caused or at least influenced by nitrosative stress, such as Alzheimers disease, ALS, inflammations, multiple sclerosis etc. Therefore cerebro spinal fluid (CSF) of 40 children and 3 adults (=43 patients) with various neurological diseases and CSF of 18 children out of a controll group was tested. The 43 patients suffered from diseases which in one way or the other could have been influenced by increased production of peroxynitrite. To show the excess of peroxynitrite production, 3-nitrotyrosine (3-NT) was measured, since peroxynitrite itself is a very instable product. 3-NT can be seen as an indicator of nitrosative stress (and peroxynitrite), since it is a stable product out of the reaction of tyrosine und peroxynitrite. High performance liquid chromotography (HPLC) combined with electrochemical detection was used to determine the amount of 3-NT. It seemed to be the method of choice because using this method even very small amounts of 3-NT could be detected. Furthermore this method isnt that expensive compared to other methods such as mass-spectroscopy, which is an important factor in routine 3-NT-investigation. At first, several experiments were made to show that our used machine worked exact and linear, and to show the influences of various parameters such as pH of mobile phase. This was followed by the investigation of CSF of patients and controll-group. But only eight out of the 43 patients had increased levels of 3-NT. In addition one child out of the cotroll group showed increased rates. The average concentration of 3-NT in the "3-NT-positive" probes was 4.73nM. In the other probes no 3-NT could be determined, that means the concentration was 0 nM. Now theres the question why only in eight out of the 43 patients an increased level of 3-NT could be detected. Three out of these eight patients were adults suffering from multiple sclerosis. All of the detected increased rates werent as high they were expected to be, compared to literature. One reason could be that never before children had been tested for 3-NT, so there is no direct comparison in literature. Mayby no 3-NT is produced in childrens brains at all, so no 3-NT could be shown in the controll group. Compared to this, the average rate of 4.73 nM 3-NT in "positive" probes could be an excessive increased level. Furthermore only free, not protein-bound 3-NT was measured. All of the in literature described 3-NT-increases were found in CSF probes, which proteins had been hydolysated before. Therefore, protein-bound-3-NT was as well detected. Protein-bound 3-NT wasnt detected in this study, so of course the detected rates were lower. Another thing is that one cant tell for sure that the detected substance really is 3-NT or another substance which has the same retention time and coelutes with 3-NT. To make sure that it is indeed 3-NT,one could gather the eluted substance and investigates it mass spectroscopidly. Finally one can say that there are many open questions,which need further studys. The CSF probes of the examined children should once more be tested for 3-NT hydrolysatinproteins. The found substanz should furthermore be definitly be identified as 3- NT. Only then the results can really be compared to results in literature. Therefore this study shall only be looked upon as a beginning of investigation in nitrosative stress causing neurological diseases in children, which has to followed by many other studys. It should be rather be looked upon as establishing a new method showing investigation starts.

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