Gewinnung von Gärungsmutanten der Hefe Pichia stipitis durch zufällige Integrationsmutagenese

Maaßen, Nicole; Klinner, Ulrich

doi:urn:nbn:de:hbz:82-opus-18450

Gewinnung von Gärungsmutanten der Hefe Pichia stipitis durch zufällige Integrationsmutagenese = Production of fermentation mutants of the yeast Pichia stipitis by random integration mutagenesis

Maaßen, Nicole (Author)

2007

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Nicole Maaßen, geb. Wieting

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2007

UmfangIV, 192 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2007

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Klinner, Ulrich (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2007-01-09

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-18450
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/61724/files/Maassen_Nicole.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Biowissenschaften, Biologie (frei) ; Insertionsmutagenese (frei) ; Pichia stipitis (frei) ; Gärung (frei) ; integration mutagenesis (frei) ; fermentation (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Pflanzen sind Energiebündel. In ihnen steckt die durch die Photosynthese gebändigte Kraft des Sonnenlichts. Jedes Mal, wenn die Treibstoffpreise hochschnellen, gerät pflanzliches Material stärker ins Blickfeld der auf Mobilität angewiesenen Industriegesellschaft. Hinzu kommt, dass die verstärkte Nutzung regenerativer Energiequellen zur Reduzierung des Ausstoßes von Treibhausgasen beitragen kann. Zu den regenerativen Energiequellen gehört Ethanol aus nachwachsenden Rohstoffen, das vor allem im Verkehrsbereich eingesetzt werden kann. Die Kosten für die Ethanolherstellung könnten durch die Nutzung von Land- und Forstwirtschaftabfällen als Rohmaterial drastisch reduziert werden. Zweithäufigster Zucker, der aus der pflanzlichen Biomasse gewonnen werden kann, ist die Pentose Xylose. Als bester Xylosevergärer gilt die im Rahmen dieser Arbeit untersuchte respiratorische Hefe Pichia stipitis. P. stipitis zeigt aber im Vergleich zu Saccharomyces cerevisiae eine geringe Ethanoltoleranz und eine geringe Ethanolbildungsrate. Zudem erfolgt die Induktion der Gärung bei P. stipitis durch eine Absenkung der Sauerstoffkonzentration im Medium. Diese physiologischen Eigenschaften erschweren die kommerzielle Nutzung von P. stipitis, da sie eine kostenintensive Prozessführung bedeuten würden. Der genaue Mechanismus der Induktion der Gärung ist bei P. stipitis nicht bekannt. Um einen rekombinanten P. stipitis oder S. cerevisiae Stamm herzustellen zu können, der zur Gewinnung von Ethanol aus Lignocellulose eingesetzt werden kann, muss der Regulationsmechanismus der Gärung aufgeklärt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein effizientes Integrationsmutagenesesystem für P. stipitis entwickelt um putative Gärungsmutanten für die Untersuchungen zu erzeugen. Dieses System führt mittels integrativer Transformation eines linearen Vektors zu zufälligen, markierten und ektopischen Integrationen. Die Verwendung eines linearisierten integrativen Vektors in einer optimierten Transformation führt zu einer 50- bis 300-fachen Erhöhung der Transformationsfrequenz. Auch die Verwendung eines linearisierten autonom-replizierenden Vektors führt gegenüber dem zirkulären autonom-replizierenden Vektor zu einer drei- bis sechsfachen Erhöhung der Transformationsfrequenz. In vielen Arbeiten führte eine als REMI (restriction enzyme-mediated integration) bezeichnete Methode zu einer Erhöhung der Transformationsausbeute. Es sollte im Rahmen dieser Arbeit eruiert werden, ob die Zugabe einer Restriktase die Transformationsfrequenz erhöht und/oder Einfluss auf den Ort oder die Häufigkeit der Integration hat. Durch Zugabe der Restriktasen BamHI, EcoRI, HincII, KpnI, PstI, SacI und XbaI kann die Transformationsfrequenz gesteigert werden. Das Ausmaß der Erhöhung ist abhängig vom Enzym, seiner eingesetzten Menge und der Vektormenge. Die Restriktase SmaI zeigt keine Erhöhung der Transformationsrate. Die Zugabe einer Restriktase während der Transformation führt bei P. stipitis nicht zu einer Integration in die entsprechende Erkennungssequenz. Die Integrationen erfolgen über Bereiche mit Mikrohomologie zum terminalen Vektor. Es finden zumeist Einzelintegrationen statt, unabhängig davon, ob ein Restriktionsenzym anwesend ist oder nicht. Zur Etablierung weiterer Selektionsmarker für P. stipitis wurden im Rahmen dieser Arbeit Komplementationsversuche durchgeführt. Dies führte zur Sequenzierung der Gene PsTRP1, PsTRP2 und PsADE5. Alle näher untersuchten putativen Gärungsmutanten erbrachten die Erkenntnis, dass es aufgrund der komplexen Regulationsmaschinerie der Ethanolbildung bei P. stipitis schwierig ist, Gärungsmutanten aufzufinden. Das Wachstumsverhalten und das Gärungsverhalten scheinen eng miteinander verknüpft zu sein. Viele der vermeintlichen Gärungsmutanten zeigten Wachstumsdefekte. Die mutierten Gene von drei verschiedenen Mutanten wurden sequenziert, es handelte sich um die Gene PsPTC1, PsINP53 und PsHSP90. Alle drei Gene sind in die Vermittlung von Stressantworten involviert und die Mutanten zeigten pleiotrope Effekte. Die Mutation im PsHSP90-Gen beeinflusst die Ethanolbildung und eventuell die Ethanolreassimilation. Weiterhin hat sie womöglich Auswirkungen auf die Funktion eines Zuckertransporters und auf die Aktivität des Enzym Xylitoldehydrogenase, eine Komponente der Xyloseverwertung. Die Mutante P. stipitis hsp90 ist nicht in der Lage, auf Xylose Ethanol zu bilden. Die Mutation im PsPTC1-Gen hat eine schnelle Bildung von länglichen Zellen und Pseudomycel zur Folge. Die Mutation im PsPTC1-Gen hat in einem Klon, der in Form von Pseudomycel wächst, einen geringeren Einfluss auf das Gärungsverhalten als in einem Klon, der runde Einzelzellen bildet. Die Mutation im PsINP53-Gen hat eine geringere Ethanolbildungsrate und wahrscheinlich eine verstärkte Ethanolreassimilation zur Folge. Grund hierfür könnte eine Verringerung der intrazellulären Phosphatidylinositol-Konzentration sein.

Plants are live wires. Through the photosynthesis the tamed strength of the sunlight imply in plants. Every time fuel-prices arise, plant material gets more strongly into the view of the industrial society depended on mobility. Additionally the reinforced utilization of regenerative sources of energy can contribute to the reduction of the output of greenhouse-gases. Ethanol from renewable primary products belongs to the regenerative sources of energy, which can be used above all in the traffic-area. The costs for the ethanol production could be drastically reduced by the utilization of agricultural and forestry residues as raw material. The pentose xylose is the second most abundant sugar in this material. The respiratory yeast Pichia stipitis examined in this dissertation is one of the best naturally occurring xylose fermenting organism known. However, P. stipitis shows a low ethanol tolerance and a low ethanol volumetric production rate in comparison to Saccharomyces cerevisiae. Moreover, the induction of the fermentation with P. stipitis takes place through a lowering of the oxygen-concentration in the medium. These physiological qualities impede the commercial utilization of P. stipitis since they would mean a cost-intensive bio processing. The exact mechanism of the induction of the fermentation in P. stipitis is not known. To be able to construct a P. stipitis or S. cerevisiae strain, which can be use efficiently in the production of ethanol from renewable biomass, the regulation-mechanism of the fermentation must be cleared up. In this dissertation an efficient integration mutagenesis was developed for P. stipitis to generate putative fermentation mutants for further examinations. This system leads to accidental, marked and ectopic integrations by means of integrative transformation of a linear vector. The application of a linearized integrative vector in an optimized transformation leads to a 50- to 300-fold increase of the transformation frequency. Also the application of a linearized autonomous-replicating vector leads in comparison to the circular autonomous-replicating vector to a three to sextuple increase of the transformation frequency. In many works, a method called REMI (restriction enzyme-mediated integration) led to an increase of the transformation-harvest. It should be investigated in this work whether the addition of a restriction enzyme increases the transformation frequency and/or has influence on the site or the frequency of the integration. The addition of the restriction enzymes BamHI, EcoRI, HincII, KpnI, PstI, SacI and XbaI increased the transformation frequency. The dimension of the increase dependents on the enzyme, its started quantity and the vector-quantity. The restriction enzyme SmaI shows no increase of the transformation rate. The presence of a restriction enzyme during the transformation doesn't lead to integration into the corresponding recognition-sequence in P. stipitis. The integrations in the chromosomal DNA occurred at micro-homologies to the terminal flanks of the linear vector. The majority of events integrated into single site, independently from presence or absence of a restriction enzyme. Further P. stipitis selection marker were executed in this work by complementation experiments. This led to the sequences from the genes PsTRP1, PsTRP2 and PsADE5. All nearer examined putative fermentation mutants showed that it is difficult to find fermentation mutants because of the complex regulation of the ethanol production in P. stipitis. Growth and fermentation seem to be joined together narrow. Many of the putative fermentative mutants showed growth-defects. The sequences of mutated genes of three different mutants were analyzed. It is about the genes PsPTC1, PsINP53 and PsHSP90. All three genes are involved in the mediation of stress answers and the mutants showed pleiotrope effects. The mutation in the PsHSP90 gene influences the ethanol production and possibly the ethanol reassimilation. Still, it possibly has effects on the function of a sugar transporter and on the activity of the enzyme xylitol dehydrogenase, a component of the xylose utilization. The mutant P. stipitis hsp90 is not able to produce ethanol from xylose. The mutation in the PsPTC1 gene leads to a fast formation of oblong cells and pseudo hyphal. The mutation in the PsPTC1 gene has an inferior influence on the fermentation-behaviour in a clone, which builds pseudo hyphal, as in a clone, which forms round single cells. The mutation in the PsINP53 gene leads to a reduced ethanol formation rate and probably a reinforced ethanol reassimilation. Reason for this could be a diminution of the intracellular phosphatidylinositol concentration.

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