Analyse der Wechselwirkungen von Proteinen des Interleukin-6-Signalwegs in einzelnen Zellen

Giese, Bernd Moritz; Müller-Newen, Gerhard

doi:26835

Analyse der Wechselwirkungen von Proteinen des Interleukin-6-Signalwegs in einzelnen Zellen

Giese, Bernd Moritz (Author)

2005

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Bernd Moritz Giese

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2005

UmfangVII, 122 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2005

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Müller-Newen, Gerhard (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2005-07-07

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-12000
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/61797/files/Giese_Bernd.pdf

Einrichtungen

Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften (100000)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Biowissenschaften, Biologie (frei) ; Interleukin-6 (frei) ; Jak1 (frei) ; GFP (frei) ; FRAP (frei) ; FRET (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Im ersten Teil der Dissertation wurde die dauerhafte Assoziation zwischen gp130 und der Janus Kinase Jak1 mittels der Messung der Fluoreszenzwiederkehr nach dem Photobleichen (fluorescence recovery after photobleaching - FRAP) nachgewiesen. Gp130 ist die gemeinsame signaltransduzierende Untereinheit der IL-6-Typ Zytokine. Die Signalübertragung durch Zytokinrezeptoren wird hauptsächlich durch nicht kovalent assoziierte Jak-Tyrosinkinasen gewährleistet. In der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie zeigten sich Fusionsproteine von gp130 und Jak1 mit gelb (YFP) bzw. cyan (CFP) fluoreszierendem Protein an der Plasmamembran und intrazellulären vesikulären Strukturen hauptsächlich kolokalisiert. Die quantitative FRAP-Analyse an der Plasmamembran ergab für gp130-YFP und Jak1-YFP gleiche Mobilitäten. Jak1 besitzt somit die gleiche Diffusionsgeschwindigkeit wie membranständiges gp130. Die gleichzeitige FRAP-Analyse zweier verschiedener Fluorophore zeigte, dass die Antikörper-induzierte Immobilisierung von gp130-CFP zu einer Ko-Immobilisierung von Jak1-YFP führt. Aufgrund der vollständigen Ko-Immobilisierung kann Jak1 als fest mit gp130 verbunden betrachtet werden. Deshalb ist zwischen gp130/Jak1-Komplexen und Rezeptor-Tyrosinkinasen eine große Ähnlichkeit erkennbar. Die gp130-Homodimerisierung und die Heterodimerisierung von gp130 mit dem LIF-Rezeptor (LIFR) wurde im zweiten Teil dieser Dissertation mit Hilfe des Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfers (FRET) und der Bimolekularen Fluoreszenzkomplementation (BiFC) in einzelnen Zellen analysiert. Interleukin-6 (IL-6) signalisiert über gp130 Homodimere, während der leukemia inhibitory factor (LIF) zur Signalweiterleitung ein Heterodimer aus gp130 und dem LIFR benötigt. Für verwandte hämatopoetische Rezeptoren wie den Erythropoetinrezeptor wurde gezeigt, dass sie als präformierte Dimere in der Plasmamembran vorliegen. In unstimulierten Zellen konnte ein FRET-Signal zwischen YFP- und CFP-markiertem gp130 gemessen werden, welches durch IL-6-Stimulation nicht erhöht wurde. Der FRET zwischen gp130-YFP und LIFR-CFP konnte jedoch durch LIF-Stimulation signifikant verstärkt werden. Die langfristige molekulare Interaktionen anzeigende BiFC-Technik ergab bei der Untersuchung von gp130-Homodimeren eine Signalerhöhung nach der Stimulation mit IL-6. Zusammenfassend legen diese Daten den Schluss nahe, dass präformierte transiente gp130-Homodimere durch IL-6 stabilisiert werden, während die Heterodimerisierung von gp130 und dem LIFR erst durch den Liganden induziert wird. Dieses Modell wird durch die Beobachtung unterstützt, dass zur effizienten Rekrutierung von fluoreszierendem IL-6 an die Plasmamembran die gleichzeitige Bindung zweier Bindungsflächen des IL-6 an zwei verschiedene gp130-Moleküle nötig ist. Dazu müssen mindestens zwei gp130-Moleküle in der Plasmamembran benachbart vorliegen.

In the first part of this thesis the long term association of the shared signalling subunit of the IL-6-type cytokines gp130 and the Janus kinase Jak1 was revealed by fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) analysis. Signal transduction through cytokine receptors is mediated mainly by non-covalently associated Jak tyrosine kinases. By confocal microscopy, the cytokine receptor gp130 and Jak1, fused with either yellow (YFP) or cyan (CFP) fluorescent protein, were found to be colocalized predominantly at intracellular vesicular structures and at the plasma membrane. Quantitative FRAP analysis at the plasma membrane revealed equal mobilities for gp130-YFP and Jak1-YFP. Thus, Jak1-YFP diffuses like a transmembrane protein indicating that membrane-bound Jak1 does not exchange rapidly with cytosolic Jaks. Applying a dual-color FRAP approach it turned out that immobilization of gp130-CFP by a pair of monoclonal antibodies led to a corresponding immobilization of cotransfected Jak1-YFP. The conclusion from these findings is that Jak1, once bound to a gp130 molecule, does not exchange between different receptors at the plasma membrane neither via the cytoplasmic compartment nor via a membrane-associated state. Thus, cytokine receptor/Jak complexes have closest analogy to receptor tyrosine kinases. The second part of the thesis is focused on the analysis of gp130 homodimerization and gp130/LIFR heterodimerization in single cells. Interleukin-6 (IL-6) signals through gp130 homodimers while leukemia inhibitory factor (LIF) exerts its action through a heterodimer of gp130 and the LIF receptor (LIFR). Related hematopoietic receptors such as the erythropoietin receptor have been described as preformed dimers in the plasma membrane. Here gp130 homodimerization and heterodimerization with the LIFR was investigated by fluorescence resonance energy transfer (FRET) and bimolecular fluorescence complementation (BiFC). It was found that in unstimulated cells a FRET signal between YFP- and CFP-tagged gp130 is clearly detectable at the plasma membrane that does not increase upon IL-6 stimulation. However, FRET between YFP- gp130 and CFP-tagged LIFR considerably increased upon LIF stimulation. Using a BiFC approach that detects stable interactions it is shown that fluorescence complementation of gp130 constructs tagged with matching "halves" of fluorescent proteins increases upon IL-6-stimulation. Taken together, these findings suggest that preformed gp130 homodimers on the plasma membrane are stabilized by IL-6 whereas heterodimerization of gp130 with the LIFR is mainly triggered by the ligand. This view is supported by the observation that the simultaneous action of two IL-6 binding domains on two gp130 molecules is required to efficiently recruit a fluorescent IL-6 (YFP-IL-6) to the plasma membrane.

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