Untersuchungen zur Funktion von Alb 3 im plastidären Proteintransport von Arabidopsis thaliana

Klostermann, Eva-Maria; Slusarenko, Alan

doi:964

Untersuchungen zur Funktion von Alb 3 im plastidären Proteintransport von Arabidopsis thaliana

Klostermann, Eva-Maria (Author)

2004

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Eva-Maria Klostermann

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2004

Umfang134 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2004

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Slusarenko, Alan (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2004-10-04

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-9640
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/61853/files/Klostermann_Eva-Maria.pdf

Einrichtungen

Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften (100000)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Ackerschmalwand (Genormte SW) ; Chloroplast (Genormte SW) ; Thylakoidmembran (Genormte SW) ; Proteintransport (Genormte SW) ; Pflanzen (Botanik) (frei) ; Oxa1-Familie (frei) ; Sec-Translokase (frei) ; Thylakoidmembran (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 580

Kurzfassung
Proteine der Oxa1-Familie sind an der Integration von Membranproteinen in die jeweiligen Membranen beteiligt. Oxa1-Homologe wurden bisher in Mitochondrien (Oxa1p), E. coli (YidC) und Chloroplasten (Alb3) genauer untersucht. Dabei ist Alb3 das bislang am wenigsten analysierte Protein. Es spielt offenbar eine Rolle in der Biogenese der Thylakoidmembran, wobei bisher nur LHC-Proteine als Substrate bekannt sind. Über den Mechanismus, mit dem diese Substrate in die Membran integriert werden, und welche genaue Rolle Alb3 bei diesem Vorgang spielt, ist bisher noch nichts bekannt. Daher sollte die Funktion von Alb3 beim Proteintransport genauer untersucht werden. In Gelpermeations-Chromatographie (GPC) Experimenten wurde gezeigt, dass Alb3 in einem höhermolekularen Komplex vorliegt. Dieser weist, abhängig vom verwendeten Detergenz, eine Größe von 160-200 kD auf. CpSecY cofraktionierte in diesen Experimenten mit Alb3. Die Auftrennung nativer Membranproteinkomplexe durch Blue Native Gele brachte den Nachweis von Alb3 und cpSecY in Komplexen diverser Größen von 120 bis ca. 700 kD. Die größte Proteinmenge befand sich in Komplexen um 160 kD, was die Ergebnisse der GPC stützt. Es wurde gezeigt, dass beide Proteine im selben Komplexen assoziiert vorliegen, da cpSecY mit Antikörpern gegen Alb3 präzipitiert werden konnte und umgekehrt. Des Weiteren erzeugte der homobifunktionale, aminoreaktive Cross-Linker DSS in Thylakoidmembranen Cross-Linking-Produkte von 90 kD Größe, die sowohl Alb3 als auch cpSecY enthielten. Im zweiten Teil der Arbeit wurde eine zu ALB3 homologe cDNA (HOM3) kloniert, die ein putatives chloroplastidäres Protein codiert. In vitro-Transkription und Translation der cDNA lieferten precursor-Proteine, die erfolgreich für Import-Experimente in intakte Chloroplasten eingesetzt wurden. Die für das Protein vorhergesagte chloroplastidäre Lokalisation konnte somit bestätigt werden. Eine Lyse der Chloroplasten zeigte, dass Hom3 in der Membranfraktion lokalisiert ist.

Members of the Oxa1 protein family mediate the integration of proteins in their respective membranes. To the date, homologs within mitochondria (Oxa1p), E. coli (YidC) and chloroplasts (Alb3) have been investigated. Alb3 is the least investigated protein of this triple. A function within thylakoid membrane biogenesis is discussed for Alb3, but the only known substrates so far are proteins of the LHCP family. Nothing is known about the mechanism by which these substrates are integrated into the thylakoid membrane, nore about the exact function of Alb3 in this process. Therefore, the role of Alb3 in protein transport has been investigated more closely. Gel permeation chromatography (GPC) experiments have shown that Alb3 is part of a high molecular protein complex. The size of this complex is dependent on the detergent used and varies about 160-200 kD. CpSecY co-fracctionates with these complexes. A range of protein complexes (160-700 kD) containing Alb3 and cpSecY have been observed in blue native gel analysis, with the main fraction residing at about 160 kD, correlating with the GPC data. Both proteins are associated within the same complex, as has been demonstrated by precipitation experiments: cpSecY was co-precipitated by antibodies raised against Alb3 and vice versa. The association within the same complex is further corroborated by the fact that crosslinking of thylakoid membranes with the homobifunctonal, aminoreactive crosslinker DSS gave raise to crosslinking products in the size about 90 kD, containing both Alb3 and cpSecY. The second part of the work is concerned with the ALB3 homolog HOM3 which codes a putative chloroplast protein. The cDNA has been cloned and precursor protein synthesized by in vitro transcription and translation. The precursor protein imported into intact chloroplasts thus confirming the chloroplast localization. Lysis of the chloroplasts showed, that Hom3 is localized within the membrane fraction.

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