Etablierung adenoviraler Genexpression zum antifibrotischen Einsatz bei der Leberfibrose

Kneifel, Jens; Gressner, Axel M.

doi:25848

Etablierung adenoviraler Genexpression zum antifibrotischen Einsatz bei der Leberfibrose

Kneifel, Jens (Author)

2004

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Jens Kneifel

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2004

UmfangIV, 69 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2004

Genehmigende Fakultät
Fak10

Hauptberichter/Gutachter
Gressner, Axel M. (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2004-06-25

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-9169
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/62034/files/Kneifel_Jens.pdf

Einrichtungen

Medizinische Fakultät (510000-1)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Medizin (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 610

Kurzfassung
Die Leberfibrose ist zurückzuführen auf ein Ungleichgewicht zwischen Synthese und Degradation von Komponenten der extrazellulären Matrix unterschiedlichster Pathogenese wie Virushepatitiden, Alkoholabusus oder Stoffwechselerkankungen. Dem Zytokin TGF-beta kommt dabei eine entscheidende Rolle zu, indem es bei Leberschädigung in die transkriptionelle Regulation von Genen eingreift, die für die Produktion und für den Abbau von Matrixproteinen verantwortlich sind. Ein Modellsystem zur in vitro Untersuchung der Leberfibrose ist die spontane Aktivierung von kultivierten hepatischen Sternzellen (HSC) auf einer Plastikoberfläche zu Myofibroblasten (MFB), den Synthesezellen der Bindegewebskomponenten. Dieser Vorgang der Transdifferenzierung stellt das Schlüsselereignis für die Entwicklung der Leberfibrose dar. Für die Unterbindung einer fortschreitenden Entwicklung der Leberfibrose ist es wünschenswert, gezielt in die Genexpression der HSC und MFB eingreifen zu können. Durch den Einsatz der adenoviralen Expressionstechnik konnte bewiesen werden, dass heterologe Gene in diese Zellen eingebracht werden können. Dabei wird eine Proteinkassette mittels homologer Rekombination in das um die E1-Region deletierte Genom des Adenovirus Typ 5 gebracht, wobei rekombinante, replikationsdefiziente Adenoviren entstehen. Als Reporterkonstrukt diente das enhanced green fluorescent protein (EGFP), das unter transkriptioneller Kontrolle des humanen Cytomegalievirus-Promotors (CMV) in HSC und MFB exprimiert wurde. Beide Zellen waren in Kultur vollständig mit dem adenoviralen Konstrukt infizierbar. Die morphologische Integrität der Adenoviren erfolgte durch Elektronenmikroskopie. Um dieses Gentransfersystem nun in vitro gegen die Leberfibrose einzusetzen, wurde das Reportergen GFP durch ein Protein mit antifibrotischem Potential ersetzt, ein löslicher TGF-beta Typ II-Rezeptor, der mit der Fc-Domäne des humanen Immunglobulin IgG fusioniert vorliegt. Der CMV - Promotor wurde beibehalten. Durch Expression dieses Rezeptors soll die Signalkaskade von TGF-beta unterbrochen werden, so dass die weitere fibrotische Wirkung von TGF-beta aufgehoben wird. Der Nachweis der Expression dieses chimären Fusionsproteins wurde sowohl auf Transkriptions- und Translationsebene als auch durch Immunpräzipitation erbracht, die biologische Aktivität durch einen Proliferationsassay bestimmt.

Liver fibrosis results from an imbalance between synthesis and degradation of extracellular matrix components due to a variety of deseases such as virus hepatitis, alcoholic abuse or metabolic dysfunction. The cytokine TGF-ß plays an important role in so far it interferes during hepatic injury with the transcriptional regulation of genes which are responsible for the production and degradation of matrix proteins. A simplified model to investigate liver fibrosis in vitro is the spontaneous activation of cultured hepatic stellate cells (HSC) on a plastic surface to myofibroblasts (MFB) which synthesize the components of the connective tissue. This process of transdifferentiation plays the key role in developing liver fibrosis. In order to prevent proceeding liver fibrogenesis it may be useful to interact with the gene expression of HSC and MFB. The use of adenoviral-mediated gene transfer proved that heterologic genes could be introduced into these cells. A protein cassette is inserted into an E1 – region-deleted adenoviral type 5 genome which now expresses recombinant, replication-deficient adenoviruses. Enhanced green fluorescent protein (EGFP) was used as a reporter construct under the transcriptional control of the human cytomegalovirus promotor (CMV). Both cell types could completely be infected in cell culture by this adenoviral construct. The morphological integrity of adenovirus was shown by electronic microscopy. In order to use this gene transfer system in vitro against liver fibrosis the reporter gene GFP was replaced by a protein with antifibrotic potential, a soluble TGF-ß type II receptor which is fusioned with the Fc-region of human immunogobuline IgG. The CMV-promotor was retained. The expression of this receptor shall interrupt the signal cascade of TGF-ß, thus inhibiting more fibrotic effects by TGF-ß. The existence of this chimeric fusion protein was assessed by Northern Blot, Western Blot and immunoprecipitation, the biological activity was confirmed by proliferation assay.

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