Studien zum Metabolismus von Pestiziden und Xenobiotika durch humane Cytochrom-P450-Monooxygenasen in transgenen Tabakzellkulturen

Bode, Maren; Schuphan, Ingolf

doi:urn:nbn:de:hbz:82-opus-9757

Studien zum Metabolismus von Pestiziden und Xenobiotika durch humane Cytochrom-P450-Monooxygenasen in transgenen Tabakzellkulturen

Bode, Maren (Author)

2004

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Maren Bode

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2004

UmfangV, 140 S. : graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2004

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Schuphan, Ingolf (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2004-01-06

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-9757
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/62053/files/Bode_Maren.pdf

Einrichtungen

Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften (100000)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Tabak (Genormte SW) ; Transgene Pflanzen (Genormte SW) ; Zellkultur (Genormte SW) ; Pestizid (Genormte SW) ; Xenobiotikum (Genormte SW) ; Oxidativer Stoffwechsel (Genormte SW) ; Cytochrom P-450 (Genormte SW) ; Biowissenschaften, Biologie (frei) ; Humane CYP1A1 und CYP1A2 (frei) ; transgene Pflanzenzellkulturen (frei) ; Biotransformation (frei) ; ECOD (frei) ; Atrazin (frei) ; Metamitron (frei) ; Dimethoat (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Detaillierte Informationen über den Metabolismus von Pestiziden in Pflanzen werden für die Zulassung benötigt, daher wurden verschiedene In-vitro-Systeme zur Gewinnung und Identifizierung von Metaboliten entwickelt, um ein breites Spektrum an möglichen Metaboliten zu generieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden transgene, pflanzliche Zellkulturen hergestellt, mit deren Hilfe ein Profil oxidierter Metabolismusprodukte von Pestiziden generiert werden konnte. Als Oxidationen-katalysierendes System kamen die humanen P450-Isoenzyme CYP1A1 und CYP1A2 zum Einsatz. Die cDNA für humanes CYP1A1 bzw. CYP1A2 wurde mittels A. tumefaciens in die Zellkultur N. tabacum L. transformiert. Für das Screening der transgenen Kallusklone und Suspensionskulturen auf ihre P450-Aktivität wurde ein für diese Enzyme spezifischer ECOD-Test (7-Ethoxycoumarin-O-deethylase-aktivität) etabliert, der in vivo mit intakten Zellen durchgeführt wurde. Die Enzymaktivität wurde anhand des im Medium verbleibenden Edukts 7-Ethoxycoumarin gemessen. Die erfolgreiche Transformation wurde, an den nach ECOD-Aktivität selektionierten Kalli, mittels PCR und Western-Blot verifiziert. Als Modellsubstanzen für die Metabolismusstudien in den transgenen Suspensionszellkuturen dienten 14C-markiertes Atrazin, Metamitron und Dimethoat. Das Herbizid Atrazin wurde in beiden Transformaden (CYP1A1 und CYP1A2) stärker einer oxidativen N-Desalkylierung unterzogen als in der nicht transgenen Ausgangskultur, dabei erwiesen sich die Kulturen mit dem Isoenzym CYP1A2 als die potenteren. In Zeitstudien konnte gezeigt werden, dass das Isoenzym CYP1A2 in erster Linie die N-Desethylierung katalysierte, während das Isoenzym CYP1A1 die N-Desisopropylierung bevorzugte. Auch bei einer zwanzigfachen Erhöhung der eingesetzten Menge an Atrazin bei gleichbleibender Zellzahl in den Kulturen mit exogenem CYP1A2 konnte gezeigt werden, dass die transgenen Kulturen eine hohe Umsatzrate gegenüber Atrazin aufwiesen. Mit Hilfe der Modellsubstanz Metamitron konnte gezeigt werden, dass die Arylhydroxylierung am Phenylring sowie die vorhergehende Desaminierung durch die beiden Isoenzyme CYP1A1 und 1A2 katalysiert wurde. Der Umsatz von Metamitron war in den transgenen Kulturen beider Isoenzyme deutlich höher als bei der nicht transformierten Kultur. In einer Zeitstudie über 48 h mit einer transgenen Kultur (CYP1A2) konnte der zeitliche Verlauf des Metamitronabbaus über das Desaminometamitron weiter zum 4-Hydroxydesaminometamitron und bis zum Glucosid des letzteren dargestellt werden. Eine zwanzigfachen Erhöhung der eingesetzten Menge an Metamitron in transgenen Kulturen mit exogenem CYP1A2 führte zu geringen Veränderungen der relativen Metabolitenverteilung, die hauptsächlich auf die langsamer stattfindende Glucosilierung zurückzuführen waren. Die transgenen Kulturen wiesen eine hohe Umsatzrate gegenüber Metamitron auf. Das Insektizid Dimethoat wurde aufgrund seiner drei potentiellen P450-Reaktionszentren als Modellsubstanz gewählt. Bei den Reaktionen handelt es sich um die oxidative Desulfurierung, N-Demethylierung und O-Demethylierung. Es zeigte sich, dass Dimethoat kein Substrat für die beiden ausgewählten Isoenzyme darstellt. Nur in den transgenen Kulturen mit CYP1A2 konnte ein leicht erhöhter Umsatz festgestellt werden, der auf die O-demethylierung zurückzuführen war. In einem abschließenden Versuch wurden Leberextrakten von mit Aroclor 1254 induzierten Ratten, die einen erhöhten Gehalt an P450-Enzymen besitzen, eingesetzt. Hierbei konnten keine Dimethoat-Metabolite nachgewiesen werden, die auf einen P450-Metabolismus zurückzuführen waren. Diese Ergebnisse zeigen, dass die transgenen Zellkulturen ein gutes Modellsystem zur Generierung von größeren Mengen an oxidierten Metaboliten von ausgewählten Pestiziden und Xenobiotika darstellen.

Detailed data on the metabolism of pesticides in plants is required for registration, therefore several in vitro systems have been developed to generate and identify a broad spectrum of possible metabolites. Therefore transgenic plant cell cultures with the human isoenzymes CYP1A1 and CYP1A2 were established for an oxidative metabolic profiling of pesticides. The cDNA of human P450 (CYP1A1 and CYP1A2) was introduced into tobacco cells (N. tabacum L.) by Agrobacterium-mediated transformation. For the screening of the transgenic calli an in vivo 7?Ethoxycoumarin O-de-ethylation (ECOD)-assay was established, which was performed with intact plant cells. The ECOD activity was measured as the concentration of non-metabolised 7?ethoxycoumarin remaining in the media. The developing transgenic calli or transgenic suspension cultures were characterised regarding their ECOD-activity. Expression of the P450 genes was further examined by PCR and western blotting. For metabolism studies in the transgenic tobacco cell cultures 14C-labelled atrazine, metamitron and dimethoat were used as model substances. The herbicide atrazine was metabolised by oxidative N-Dealkylation. The conversion rate was considerably higher in the transformed cell cultures (CYP1A1 and CYP1A2) than in non-transformed cell culture. However, CYP1A2 exhibited a higher conversion rate than CYP1A1. In a time-course study the enzyme CYP1A2 catalysed predominately N-deethylation whereas the enzyme CYP1A1 catalysed predominately the N-deisopropylation. In experiments with a constant amount of CYP1A2 plant cell culture the originally used concentration of atrazine was raised up to a 20fold quantity. In these large-scale experiments the high activity of the transgenic clones was demonstrated. Metabolism studies with the herbicide metamitron demonstrated that the arylhydroxylation and the previous desamination both can be catalysed by the isoenzymes CYP1A1 and CYP1A2. The conversion rate was considerably higher in the transformed cell cultures (CYP1A1 and CYP1A2) than in non-transformed cell culture. However, CYP1A2 exhibited a higher conversion rate than CYP1A1. In a time-course study using a CYP1A2 cell culture the transformation of metamitron could be demonstrated, starting with the formation of the metabolite desaminometamitron, followed by 4?hydroxydesaminometamitron and ended with the glucosid of the later. In experiments with a constant amount of CYP1A2 plant cell culture the originally used concentration of metamitron was raised up to a 20fold quantity. In these large-scale experiments the relative metabolic profile had changed slightly. This was due to the slower glucosylation compared to P450-oxidation. Therefore a high P450 activity of the transgenic clones was demonstrated. The third substance used was the insecticide dimethoate with three potential P450 reaction centres present in this molecule. The three reactions are the desulfuration, N-demethylation and O-demethylation. Nevertheless, there was no evidence that dimethoat was a suitable substrate for the two P450 isoenzymes. Only a slight increase in the conversion rate of dimethoate could be found by the CYP1A2 enzyme which was attributed to the O-demethylation. Finally the metabolism of dimethoate was tested in liver microsomes of rats, which were prior induced with Aroclor 1254 to increase the P450 enzyme activity. On the basis of the obtained results it is obvious, that dimethoate is not metabolised by P450-isoenzymes in rats. Plant cell cultures in which the appropriate P450 cDNAs are introduced, appear to be suitable in vitro systems in order to produce large quantities of primary oxidised pesticide metabolites.

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