Konstruktion und Charakterisierung von rekombinanten Immuntoxinen zur Therapie von metastasierendem Pankreaskarzinom

Brüll, Daniela; Fischer, Rainer

doi:HT014242552

Konstruktion und Charakterisierung von rekombinanten Immuntoxinen zur Therapie von metastasierendem Pankreaskarzinom

Brüll, Daniela (Author)

2004

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Daniela Brüll

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2004

UmfangVI, 150 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2004

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Fischer, Rainer (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2004-11-26

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-9922
DOI: 10.18154/RWTH-CONV-123655
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/62057/files/62057.pdf

Einrichtungen

Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften (100000)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Medizin (frei) ; rekombinante Immuntoxine (frei) ; EGFR (frei) ; scFv (frei) ; Pankreaskarzinom (frei) ; Pseudomonas Exotoxin A (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 610

Kurzfassung
Pankreaskarzinome sind die fünft häufigste Krebstodesursache bei Männern und Frauen in Europa und Nordamerika. Hauptgründe für die hohe Mortalitätsrate liegen in der späten Diagnose der Erkrankung, dem hochaggressiven und invasiven Tumorwachstum sowie der frühen Ausprägung von lymphogenen und hämatogenen Metastasen. Die derzeitig angewendeten Chemo- und Radiotherapien gewährleisten keine vollständige Eliminierung von residualen Zellen und führen oftmals zu beträchtlichen Nebenwirkungen aufgrund ihrer Unspezifität. Aus diesem Grunde müssen dringend neue und effizientere Diagnose- und Therapiestrategien entwickelt werden. Der Einsatz anti-EGFR spezifischer rekombinanter Immuntoxine stellt eine vielversprechende Alternative zu den konventionell angewendeten Therapien des Pankreaskarzinoms dar. Da der EGFR im Vergleich zu nicht malignen Zellen auf den pankreatischen Tumorzellen überexprimiert ist, bietet sich dieser Rezeptor als ideales Zielantigen für die Bindung von Immuntoxinen an, die nach Internalisierung und Freisetzung der toxischen Domäne die Tumorzelle zu eliminieren vermögen. Im Rahmen dieser Dissertation gelang die Konstruktion und Charakterisierung von mehreren EGFR spezifischen Immuntoxinen im Hinblick auf eine mögliche Therapie des Pankreaskarzinoms. Zunächst wurde ein chimäres Immuntoxin, bestehend aus dem murinen anti-EGFR 425(scFv)-Fragment und einer Deletionsmutante des Pseudomonas Exotoxin A (ETA’) kloniert. Das Fusionsprotein wurde periplasmatisch unter osmotischem Stress in Anwesenheit von kompatiblen Soluten in E. coli exprimiert und anschließend gereinigt. Nachfolgend wurde 425(scFv)-ETA' in vitro charakterisiert. Die Aktivität der Bindungsdomäne gegenüber den EGFR-positiven Pankreaskarzinomzelllinien L3.6pl und FG wurde dabei mittels Durchflusszytometrie, Zellmembran-ELISA und Immunofluoreszenz-Mikroskopie verifiziert. XTT-basierende Zytotoxizitätsassays zeigten, dass die toxische Domäne ETA’ ebenfalls funktional war. Die IC50, d.h. die Konzentration eines Proteins, die eine 50%ige Inhibition der Zellproliferation bewirkt, betrug für 425(scFv)-ETA' 0,0075 µg/ml auf L3.6pl Zellen und 0,0080 µg/ml auf FG Zellen. Neben der Bestätigung der in vitro Aktivität von 425(scFv)-ETA' wurde die biologische Aktivität des Immuntoxins in einem disseminierten Pankreaskarzinommodell in immundefizienten Mäusen untersucht. Dabei stellte sich heraus, dass die einmalige und wiederholte intravenöse Gabe von 425(scFv)-ETA' zu einer signifikanten Reduktion der Anzahl der durch disseminiert wachsende L3.6pl Zellen hervorgerufenen Lungenmetastasen führte, was die anti-Tumoraktivität von 425(scFv)-ETA' in vivo verifizierte. Zur Reduktion der Immunogenität der anti-EGFR Immuntoxine wurden im zweiten Teil der Arbeit Fusionsproteine generiert, die als toxische Domäne die humanen Enzyme (hE) Angiogenin (Ang), Granzym B (Gb) und das eosinophil-kationische Protein (ECP) enthielten. Es wurden 425(scFv)-Immuntoxine mit sowohl C-terminal als auch N-terminal lokalisierten toxischen Domänen konstruiert. Die in eukaryotischen HEK293T Zellen exprimierten 425(scFv)-hE und hE-425(scFv) Immuntoxine wurden über eine Ni2+-NTA-Affinitätschromatographie gereinigt und anschließend in die in vitro Assays eingesetzt. Mittels Durchflusszytometrie und Zellmembran-ELISA wurde die Bindungsaktivität der Fusionsproteine nachgewiesen. Zytotoxizitätsassays erbrachten den Nachweis, dass 425(scFv)-Ang und 425(scFv)-Gb eine zytotoxische Aktivität gegenüber L3.6pl Zellen aufwiesen, wobei die IC50 bei 0,430 bzw. 0,380 µg/ml lag. Die entsprechenden Immuntoxine mit N-terminal lokalisierten Enzymen, Ang-425(scFv) und Gb-425(scFv), zeigten dagegen eine geringere zytotoxische Aktivität. Die im Vergleich zu 425(scFv)-ETA' schlechtere IC50 von 425(scFv)-Ang und 425(scFv)-Gb ist möglicherweise durch eine unzureichende Translokation der Effektordomänen ins Zytosol zu erklären, da im Gegensatz zu ETA diese Effektordomänen natürlicherweise keine Translokationsdomäne enthalten. Dementsprechend wurden Immuntoxine generiert, in denen der N-Terminus der hE mit einer Deletionsmutante der Translokationsdomäne von ETA fusioniert wurde. Die resultierenden Fusionsproteine 425(scFv)-dII-Ang und 425(scFv)-dII-Gb konnten in HEK293T Zellen exprimiert werden und zeigten Bindungsaktivität gegenüber dem EGFR. Jedoch konnte die zytotoxische Aktivität von 425(scFv)-Ang und 425(scFv)-Gb durch Insertion der Translokationsdomäne alleine nicht verbessert werden. Abschließend ist zu sagen, dass die innerhalb dieser Arbeit beschriebenen rekombinanten anti-EGFR Immuntoxine sehr erfolgversprechende Kandidaten zur Therapie von metastasierendem Pankreaskarzinom darstellen. Vor allem das Immuntoxin 425(scFv)-ETA' zeigte in vivo eine hohe anti-Tumoraktivität und ist als potentielles Therapeutikum für weitere klinische Studien einsetzbar.

Pancreatic carcinoma is the fifth leading cause of cancer-related deaths in North America and Europe. Major reasons for the high mortality rate are the inability to detect pancreatic cancer at an early stage, extensive local invasion and early formation of lymphatic and hematogenous metastases. Including the conventional treatments for cancer like surgery, chemotherapy and radiotherapy, there is presently no efficient therapy for advanced pancreatic carcinoma which might be able to significantly improve the outcome of the patients. Main problems are multiple unacceptable side effects resulting from high dose chemotherapy and a strong resistance of pancreatic carcinoma to both, chemo- and radiotherapy. Consequently, novel effective therapies have to be urgently developed. Immunotherapy, comprising the application of monoclonal antibodies, immunotoxins or bispecific antibodies, is a promising alternative for treatment of pancreatic carcinoma. Since overexpression of EGF receptor (EGFR) in pancreatic tumors correlates with advanced clinical staging, tumor size and decreased survival of patients, it represents an appropriate target for antibody-based immunotherapy. In this thesis the construction and characterisation of several EGFR-specific recombinant immunotoxins with regard to a possible therapy of pancreatic carcinoma is described. First of all the recombinant immunotoxin 425(scFv)-ETA’ was generated by genetically fusing the anti-EGFR single chain fragment 425(scFv) to a truncated mutant of Pseudomonas exotoxin A (ETA’). Using the expression vector pBM1.1, functional 425(scFv)-ETA’ was periplasmically expressed under osmotic stress conditions in the presence of compatible solutes. Binding activity of the purified immunotoxin to the EGFR-positive pancreatic carcinoma cell lines L3.6pl and FG was confirmed by flow cytometry, ELISA and immunofluorescence-microscopy. XTT-based cell proliferation assays showed that the toxic domain of the fusionprotein was functional as well. The median IC50, which is the concentration of a protein leading to 50% inhibition of cell proliferation, was calculated to be 0,0075 µg/ml for L3.6pl cells and 0,008 µg/ml for FG cells, respectively. Furthermore the anti-tumor effect of this recombinant immunotoxin was confirmed using a disseminated human pancreatic cancer nude mouse model. After intravenous injection of L3.6pl cells into immunodeficient nude mice, both, single and repeated intravenous administration of 425(scFv)-ETA’ resulted in a significant reduction of the average amount of lung metastases, verifying the anti-tumor activity of 425(scFv)-ETA’ in vivo. To reduce the immunogenicity of anti-EGFR immunotoxins, fusionproteins containing human enzymes (hE) as toxic domains were generated in the second part of this doctoral thesis. Therefore 425(scFv) was genetically fused to the N- and C-termini of recombinant angiogenin (Ang), eosinophilic cationic protein (ECP) and granzyme B (Gb) by insertion into the eucaryotic expression vector pMS. A leader sequence was mediating the secretion of the 425(scFv)-hE and hE-425(scFv) immunotoxins into the cell culture supernatant of eucaryotic HEK293T cells. After purification by metal-ion affinity chromatography the binding activity of the fusionproteins to the EGFR-positive cell lines L3.6pl and FG was confirmed by flow cytometry and ELISA. Cytotoxicity assays showed that 425(scFv)-Ang and 425(scFv)-Gb exhibited specific cytotoxicity against L3.6pl cells reaching an IC50 of 0,380 µg/ml and 0,430 µg/ml, respectively. In contrast, the corresponding immunotoxins with N-terminal located hE, Ang-425(scFv) and Gb-425(scFv), showed a lower cytotoxic activity towards pancreatic carcinoma cells. A possible reason for the lower IC50 of 425(scFv)-Ang and 425(scFv)-Gb compared to the IC50 of 425(scFv)-ETA’ could be an inadequate translocation of the effector domains into the cytosol, as in contrast to ETA’ the human enzymes naturally contain no translocation domain. Accordingly anti-EGFR specific immunotoxins were generated, containing a truncated mutant of the translocation domain of ETA’ at the N-terminus of hE. The resulting fusionproteins 425(scFv)-dII-Ang and 425(scFv)-dII-Gb were successfully expressed in HEK293T cells and possessed binding activity towards the EGFR. However, the cytotoxicity of 425(scFv)-Ang and 425(scFv)-Gb could not be improved by insertion of the translocation domain. In summary, this thesis shows that the generated recombinant anti-EGFR immunotoxins are promising candidates for the treatment of metastatic pancreatic carcinoma. In particular, 425(scFv)-ETA’ exhibited in vivo a strong anti-tumor effect and might be suitable for further clinical investigation.

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