Therapeutic application of dominant-negative PDGF beta-receptor in liver fibrosis

Borkham-Kamphorst, Erawan; Gressner, Axel M.

doi:urn:nbn:de:hbz:82-20050593

Therapeutic application of dominant-negative PDGF beta-receptor in liver fibrosis

Borkham-Kamphorst, Erawan (Author)

2004 & 2005

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Erawan Borkham-Kamphorst

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2004

UmfangXVI, 120 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2004

Prüfungsjahr: 2004. - Publikationsjahr: 2005

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Gressner, Axel M. (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2004-11-10

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-20050593
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/62084/files/Borkham-Kamphorst_Erawan.pdf

Einrichtungen

Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften (100000)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Medizin (frei) ; PDGF (frei) ; Soluble PDGF-beta Receptor (frei) ; Adenovirus (frei) ; Liver Fibrosis (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 610

Kurzfassung
Leberverletzungen führen zu einer Aktivierung hepatischer Sternzellen (HSC) und einer phänotypischen Umwandlung dieser Zellen zu kontraktilen Myofibroblasten. Diese zeichnen sich durch eine erhöhte Motilität, Kontraktilität und Produktion extrazellulärer Matrix aus. Diese zelluläre Aktivierung wird reguliert durch verschiedene Zytokine und Wachstumfaktoren, einschließlich des Platelet-derived growth factors (PDGF-BB). Dieser Wachstumsfaktor bindet an spezifische Rezeptoren (PDGFR), die dimerisieren und an spezifischen Tyrosinresten autophosphoryliert werden. In deren Folge werden spezifische Signalwege, unter anderem die MAPK- und des PI3K-Signalwege aktiviert. Diese durch PDGF-vermittelten Signalwege stellen ein mögliches therapeutisches Ziel dar, um das Fibrosegeschehen in der Leber zu modulieren. In der vorliegenden Arbeit wurde ein dominant-negativer, löslicher Rezeptor kloniert, in dem die extrazellulare Dömäne des PDGF-Rezeptors (PDGFRBeta) mit dem IgG-Fc Teil eines menschlichen Immoglobulins fusioniert wurde. Durch adenoviral vermittelten Gentransfer wurde dieses Konstrukt in Cos-7 und HSC eingebracht und seine Expression untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass durch Infektion mit dem entsprechenden Adenovirus (Ad5-CMV-sPDGFRBeta) das chimäres Protein produziert und in das Kulturmedium ausgeschieden wird. In diesem Protein sind jeweils zwei einzelne Aminosäurenketten über die Cysteinreste des IgG-Fc Teils miteinander verbunden. Das sekretierte Protein wurde gereinigt und es konnte nachgewiesen werden, dass der lösliche PDGFR den Liganden (PDGF) binden und die Autophosphorylierung des endogenen Rezeptors inhibieren kann. Ebenso konnte nachgewiesen werden, dass der durch PDGF aktivierte ERK1/ERK2 Signalweg blockiert werden kann. Ebenso führte die Applikation des artifiziellen Rezeptors zu einer Proliferationshemmung und einer verringerten Kollagenexpression. Auch der autokrine Expressionsloop des PDGFs und die Expression von Thrombospondin, einem wichtigen Aktivator des latenten TGF-Beta , konnte durch Infektion mit Ad5-CMV-sPDGFRBeta verringert werden. Der lösliche Rezeptor war zudem in der Lage, die Expression typischer Fibrosemarker, wie zum Beispiel Alpha-SMA und Kollagen I(AlphaI), in dem Gallengangsligatur-Modell der Ratte zu senken. Dabei war es unerheblich, ob der lösliche Rezeptor durch adenovirale Expression eingebracht oder das gereinigte Protein eingesetzt wurde. Zusammenfassend zeigten diese Experimente das starke antifibrotische Potential dieses PDGF-Antagonisten in verschiedenen Modellen der experimentell induzierten Leberfibrose.

Upon liver injury hepatic stellate cells (HSC) undergo phenotype transformation with acquisition of myofibroblast-like features characterized by increased cell proliferation, motility, contractility and extra cellular matrix production. HSC activation is regulated by several cytokines and growth factors including platelet derived growth factor B-chain (PDGF-BB) which exerts cellular effects by binding to PDGF receptors (PDGFR) and further inducing receptor dimerization and tyrosine-autophosphorylation, thus initiating various signaling pathways, amongst which MAPK and PI3K as principals. These PDGF signaling pathways may provide a potential therapeutic target to modulate the fibrotic response in liver. We therefore generated a dominant-negative soluble PDGFR consisting of PDGFRBeta extracellular domains connected to the IgG-Fc part of human immoglobulin, and used adenovirus type 5 mediated gene transfer into Cos-7 cells and HSC. This Ad5-CMV-sPDGFRBeta construct produced a secreted chimeric protein with two cystein residues at the hinge region of the IgG-Fc part, culminating in predimerized soluble receptors. This PDGFRBeta secreted efficiently into the conditioned media of both Cos-7 cells and HSC and binds PDGF-BB. The secreted protein from Cos-7 cells was purified and applied to test its inhibitory effects on PDGF signaling in HSC. The soluble PDGFRBeta did inhibit autophosphorilation of endogenous membrane-bound receptors upon PDGF stimulation and completely blocked p44 and p42 (ERK1 and ERK2) phosphorylation. PDGF activation of ERK triggers proliferative responses in HSC, further underlining that our sPDGFRBeta inhibits HSC proliferation and DNA synthesis along with inhibition of PDGF-induced PI3K/Akt activation, thus leading to reduced collagen type I(Alphal) gene expression. Adenovirus-mediated sPDGFRBeta gene transfer in HSC in vitro proved highly effective. Infected HSC produced the soluble receptor to scavenge available PDGF-BB and inhibit HSC proliferation. Ad5-CMV-sPDGFRBeta infected HSC did inhibit also autocrine looping on PDGF mRNA production resulting in decreased expression of thrombospondin-1, a latent TGF-Beta activator, leading to decreased fibrogenesis as proven by reduced levels of collagen type I(Alphal) mRNA compared to the control cultures.We then used a bile duct ligation (BDL) rat model to examine the effects of sPDGFRBeta on hepatic fibrogenesis. It is known that expression of PDGFRBeta-subunit does increase during experimental liver injury. In our model both approaches, adenovirus mediated sPDGFRBeta gene transfer and direct application of sPDGFRBeta as purified protein, significantly attenuated ongoing fibrosis in BDL rats as evidenced by reduced expression of Alpha-SMA and collagen type I(AlphaI). In conclusion, our experiments did demonstrate the potent antifibrogenetic effects of sPDGFRBeta, a PDGF antagonist, in experimentally induced liver fibrosis.

OpenAccess:
PDF
(additional files)