Identifizierung und funktionelle Charakterisierung des Spleißfaktors SRp30c als Interaktionspartner des Y-box-Proteins-1 (YB-1)

Frye, Björn Christian; Mertens, Peter R.

doi:10.18154/RWTH-CONV-123694

Identifizierung und funktionelle Charakterisierung des Spleißfaktors SRp30c als Interaktionspartner des Y-box-Proteins-1 (YB-1)

Frye, Björn Christian

2004

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Björn Christian Frye

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2004

Umfang145 S. : graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2004

Genehmigende Fakultät
Fak10

Hauptberichter/Gutachter
Mertens, Peter R. (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2004-12-17

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-10980
DOI: 10.18154/RWTH-CONV-123694
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/62100/files/62100.pdf

Einrichtungen

Medizinische Fakultät (510000-1)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
nicht belegt (Genormte SW) ; Medizin (frei) ; YB-1 (frei) ; SRp30c (frei) ; splicing (frei) ; two-hybrid screen (frei) ; gene regulation (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 610

Kurzfassung
Das Y-box Protein-1 (YB-1) ist Mitglied der Kälteschockproteinfamilie und bindet sequenzspezifisch an DNA wie RNA. Funktionen bei der Transkription, RNA-Prozessierung, -Translation und –Speicherung sind für YB-1 beschrieben, die durch Interaktionen mit zahlreichen anderen Proteinen vermittelt werden. In der vorliegenden Arbeit wurde ein two hybrid-System mit YB-1 als Köderprotein etabliert, um systematisch Interaktionspartner von YB-1 zu identifizieren. Eine cDNA-Bibliothek humaner Mesangialzellen wurde generiert, in ein Expressionsplasmid mit der Gal4-Transaktivierungsdomäne kloniert und diente als Opferproteine (prey). Nach Durchsuchen von insgesamt 5.8 x 10 6 Hefekoloniern wurden 44 als positiv identifiziert und bezüglich vier Selektionskriterien bestätigt. Ein mit dieser Methode gefundener Interaktionspartner, das Spleißprotein SRp30c wurde näher untersucht. Durch Co-Immunpräzipitationen wurde eine direkte Proteininteraktion zwischen YB-1 und SRp30c bestätigt, welche auch in Abwesenheit von RNA durch zwei YB-1-Subdomänen (N-Terminus inklusive cold shock Domäne sowie C-Terminus) vermittelt wird. Ferner konnte gezeigt werden, dass der zelluläre SRp30c-Gehalt die Lokalisation von YB-1 beeinflußt. In proliferierenden Zellen liegt YB-1 zytoplasmatisch lokalisiert vor, bei Überexpression von SRp30c liegt YB-1 nukleär vor und kolokalisiert mit SRp30c. Die Kolokalisation ist anhängig vom YB-1-N-Terminus, nicht jedoch vom YB-1-C-Terminus. Ein zellulärer Hitzeschock führt zu einer nukleären Kompartimentierung von SRp30c in Streß-induzierten Körperchen. Unter diesen Bedingungen ist die nukleäre Co-Lokalisation von YB-1 und SRp30c aufgehoben. Die funktionelle Relevanz der Interaktion wurde in Spleißversuchen mit einem E1A-Minigen herausgearbeitet. Dieses Modellsystem zur Untersuchung von Spleißprozessen enthält 3 alternative 5‘-Spleißstellen, die zu drei Isoformen (13S, 12S und 9S) führen. Für SRp30c konnte bereits eine Bevorzugung der 13S-Isoform gezeigt werden. Bei Überexpression von YB-1 kommt es zu einer konzentrationsabhängigen Verminderung der 13S-Isoform und Zunahme der 12S-Isoform. Diese Änderungen legen nahe, dass YB-1 die Rolle eines Adaptermoleküls übernimmt, indem YB-1 an RNA-Sequenzen bindet und über die Interaktion mit SRp30c eine Änderung des alternativen Spleißens bewirkt.

The multifunctional DNA- and RNA-associated Y-box protein 1 (YB-1) specifically binds to splicing recognition motifs and regulates alternative splice site selection. Here, we identify the arginine/serine-rich SRp30c protein as an interacting protein of YB-1 by performing a two-hybrid screen against a human mesangial cell cDNA library. Co-immunoprecipitation studies confirm a direct interaction of tagged proteins YB-1 and SRp30c in the absence of RNA via two independent protein domains of YB-1. A high affinity interaction is conferred through the N-terminal region. We show that the subcellular YB-1 localization is dependent on the cellular SRp30c content. In proliferating cells, YB-1 localizes to the cytoplasm, whereas FLAG-SRp30c protein is detected in the nucleus. After overexpression of YB-1 and FLAG-SRp30c, both proteins are co-localized in the nucleus, and this requires the N-terminal region of YB-1. Heat shock treatment of cells, a condition under which SRp30c accumulates in stress-induced Sam68 nuclear bodies, abrogates the co-localization and YB-1 shuttles back to the cytoplasm. Finally, the functional relevance of the YB-1/SRp30c interaction for in vivo splicing is demonstrated in the E1A minigene model system. Here, changes in splice site selection are detected, that is, overexpression of YB-1 is accompanied by preferential 5' splicing site selection and formation of the 12 S isoform.

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