Expression, Reinigung und Charakterisierung von Makrolid-Glykosyltransferasen für die Synthese neuartiger Makrolid-Antibiotika

Schumacher, Thomas; Hartmeier, Winfried; Elling, Lothar

doi:urn:nbn:de:hbz:82-opus-11034

Expression, Reinigung und Charakterisierung von Makrolid-Glykosyltransferasen für die Synthese neuartiger Makrolid-Antibiotika

Schumacher, Thomas (Author)

2005

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Thomas Schumacher

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2005

UmfangVI, 207 S. : Ill, graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2005

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Elling, Lothar (Thesis advisor)^RWTH* ; Hartmeier, Winfried (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2005-02-24

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-11034
DOI: 10.18154/RWTH-CONV-123696
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/62102/files/62102.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Saccharopolyspora erythraea (Genormte SW) ; Genexpression (Genormte SW) ; Glycosyltransferasen (Genormte SW) ; Makrolidantibiotikum (Genormte SW) ; Kombinatorische Synthese (Genormte SW) ; Biokatalyse (Genormte SW) ; Biowissenschaften, Biologie (frei) ; Naturstoffe (frei) ; Makrolid-Antibiotika (frei) ; Makrolid-Glykosyltransferasen (frei) ; Expression (frei) ; Aufreinigung (frei) ; Charakterisierung (frei) ; kombinatorische Biokatalyse (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Die Makrolid-Glykosyltransferasen EryCIII, EryBV, OleG2 und TylMII wurde durch Fermentation von Saccharopolyspora erythraea im Labormaßstab produziert und die lösliche Expression aller Glykosyltransferasegene durch Immunoblotting und ELISA gegen den C-terminalen His6-tag der rekombinanten Enzyme nachgewiesen. Dabei wurden beispielsweise bei einer Fermentation von Saccharopolyspora erythraea pEXCIII auf Minimalmedium im 30-L-Maßstab 481 g Biofeuchtmasse gewonnen. Anhand der Desosaminyltransferase EryCIII wurde eine exemplarische Aufreinigungsstrategie für die Glykosyltransferasen entwickelt und EryCIII bis zur Homogenität aufgereinigt. Die Aufreinigungsstrategie setzte sich dabei aus Anionenaustauschchromatographie, IMAC und Gelfiltration zusammen. Ausgehend von 80 g Biofeuchtmasse wurden über eine präparative Aufreinigung durch Anionenaustausch und IMAC 72 mg EryCIII dargestellt. Bei der Bestimmung des nativen Molekulargewichts von EryCIII ließen sich sowohl Di- (98,3 kDa) als auch Trimere (130,7 kDa) nachweisen, aber überraschenderweise keine Monomere. Die Bestimmung der spezifischen Aktivität der Probe ergab einen Wert von 80 mU/mg. Während der biochemischen Charakterisierung zeigte sich, dass das pH-Optimum für die Reaktion von EryCIII im Bereich von pH 9 und das Temperaturoptimum bei 25°C liegt, und dass das Enzym seine enzymatische Aktivität über einen weiten pH- (pH 7 - 11) und Temperaturbereich (25°C - 45°C) entfalten kann. Die Untersuchung der thermischen Inaktivierung bei 30°C ergab für IMAC gereinigtes EryCIII eine Halbwertszeit von mehr als 2 Tagen. Somit ist EryCIII für den Einsatz in der kombinatorischen Biokatalyse gut geeignet. Weiterhin ist festzuhalten, dass EryCIII erstmalig in der in vitro Synthese von Makrolid-Antibiotika eingesetzt wurde. Neben Erythromycin D und Narbomycin wurden zwei neuartige Makrolid-Antibiotika, Desosaminyl-Rhamnosyl-Erythronolid B und Desosaminyl-Olivosyl-Erythronolid B, hergestellt. Die Produkte wurden über Massenspektrometrie identifiziert und wiesen eine antibiotische Aktivität gegen den Teststamm Kocuria rhizophila (ATCC 9341) auf. Untersuchungen zur Michaelis-Menten-Kinetik von EryCIII haben offenbart, dass Mycarosyl-Erythronolid B (MEB) und Rhamnosyl-Erythronolid B (REB), im Gegensatz zu Narbonolid und dTDP-D-Desosamin, zu einer deutlichen Substratüberschussinhibition führen (MEB: Ki = 4,0 ± 2,4 mM; REB: Ki = 2,7 ± 1,5 mM). Außerdem ergaben weitere Studien, dass sich die Enzymkinetik für Narbonolid signifikant von den anderen Enzymkinetiken unterscheidet. Dies zeigte sich besonders im sehr niedrigen Vmax-Wert von 3,8 ± 0,18 mU/mg (MEB: Vmax = 98,8 ± 37,7 mU/mg; REB: Vmax = 89,2 ± 35,5 mU/mg). Der Vergleich der Km-Werte zeigt weiterhin, dass EryCIII eine überraschend starke Affinität zu Narbonolid hat (Km = 0,3 ± 0,09 mM) und dass die Affinität für Mycarosyl-Erythronolid B (Km = 1,4 ± 0,96 mM) erwartungsgemäß größer ist als für Rhamnosyl-Erythronolid B (Km = 1,7 ± 1,1 mM). Für das Donorsubstrat dTDP-D-Desosamin wurde ein Vmax-Wert von 59,9 ± 1,6 mU/mg und ein Km-Wert von 1,3 ± 0,14 mM festgestellt. Vor dem Hintergrund eines Enzym-Modul-Systems für die Synthese von neuartigen Makrolid-Antibiotika durch kombinatorische Biokatalyse wurde ein System untersucht, das die in situ Regeneration von nukleotid-aktivierten Desoxyzuckern mit der Glykosylierung eines Akzeptormoleküls koppelt. Erste Versuche haben am Beispiel von EryCIII gezeigt, dass das Glykosyltransferase-Modul erfolgreich etabliert und mit dem SuSy- und dem Desoxyzucker-Modul verbunden werden konnte. Das bei der Glykosylierungsreaktion freiwerdende dTDP wurde mit Hilfe der Sucrose Synthase 1 aus Kartoffel und der dTDP-6-Desoxy-4-keto-D-glucose Dehydratase RmlB aus Salmonella typhimurium erfolgreich zur in situ Herstellung von dTDP-6-Desoxy-4-keto-D-glucose genutzt. Des Weiteren haben erste Versuche mit immobilisiertem EryCIII (Ni-NTA) gezeigt, dass das Enzym in immobilisierter Form verwendbar ist.

The macrolide glycosyltransferases EryCIII, EryBV, OleG2 and TylMII were produced by medium-scale fermentation of recombinant Saccharopolyspora erythraea strains. The soluble expression of all glycosyltransferase genes was verified by immunoblotting and ELISA against the C-terminal polyhistidine-tag of the enzymes. During a 30 L cultivation of Saccharopolyspora erythraea pEXCIII on minimal medium 480 g cells (moist mass) were obtained. Considering the desosaminyl transferase EryCIII as an example a general purification strategy for the macrolide glycosyltransferases was developed. The strategy consists of anion exchange chromatography, IMAC and gelfiltration and was used to purify EryCIII to homogeneity. Starting from 80 g cells 72 mg of EryCIII were isolated after anion exchange chromatography and IMAC. Determination of the native molecular weight of EryCIII revealed molecular masses of 98.3 kDa and 130.7 kDa respectively which indicated that EryCIII exists at least as an enzyme dimer. Interestingly no enzyme monomers were observed. After gelfiltration a specific activity of 80 mU/mg was achieved. The optimum temperature for the reaction of EryCIII was found to be 25°C at a pH optimum of pH 9. Further studies showed that the enzyme could develop its enzymatic activity over a broad range of pH values (7 - 11) and temperatures (25°C - 45°C). Thermal inactivation tests at 30°C resulted in a half-life of more than 2 days for IMAC purified EryCIII which makes the enzyme suitable for enzymatic syntheses. In addition EryCIII was used for the first time in the in vitro synthesis of macrolide antibiotics. Beside erythromycin D and narbomycin two novel macrolide antibiotics, desosaminyl-rhamnosyl-erythronolide B and desosaminyl-olivosyl-erythronolide B were produced. All products were identified by HPLC-MS and the calculated molecular masses were confirmed. Tests with a susceptible test strain (Kocuria rhizophila (ATCC 93419)) showed an antibiotic effect for all products. Throughout the study of the Michaelis-Menten kinetics of EryCIII for different substrates it was found that the enzyme was inhibited by the acceptor substrates mycarosyl-erythronolide B (Ki = 4.0 ± 2.4 mM) and rhamnosyl-erythronolide B (Ki = 2.7 mM ± 1.5 mM) but not by narbonolide or the donor substrate dTDP-D-desosamine. The Vmax and Km values for mycarosyl-erythronolide B (Vmax = 98.8 ± 37.7 mU/mg, Km = 1.4 ± 0.96 mM), rhamnosyl-erythronolide B (Vmax = 89.2 ± 35.5 mU/mg, Km = 1.7 ± 1.1 mM) and narbonolide (Vmax = 3.8 ± 0.18 mU/mg, Km = 0.3 ± 0.09 mM) indicated that EryCIII has a high affinity for the non-natural acceptor substrate narbonolide but an extremely low conversion rate. For dTDP-D-desosamine a Vmax value of 59.9 ± 1.6 mU/mg and a Km value of 1.3 ± 0.14 mM was determined. Against the background of an enzyme-module-system for the synthesis of novel macrolide antibiotics by combinatorial biocatalysis a system was examined that combines the in situ regeneration of nucleotide activated deoxysugars from dTDP and sucrose with the glycosylation of an acceptor molecule. In this system EryCIII was successfully used for the production of erythromycin D and the byproduct dTDP was used by the sucrose synthase 1 from potato and by the dTDP-6-deoxy-4-keto-D-glucose dehydratase RmlB from Salmonella typhimurium for the in situ generation of dTDP-6-deoxy-4-keto-D-glucose. Furthermore first tests with Ni-NTA immobilized EryCIII showed that the enzyme can be utilized in immobilized form.

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