Klonierung, Sequenzierung und Charakterisierung der genetischen Determinante des CAMP-Faktors (=cbf-Gen) der Gruppe-B-Streptokokken (Streptococcus agalactiae)

Blankenstein, Oliver; Lütticken, Rudolf

doi:26837

Klonierung, Sequenzierung und Charakterisierung der genetischen Determinante des CAMP-Faktors (=cbf-Gen) der Gruppe-B-Streptokokken (Streptococcus agalactiae)

Blankenstein, Oliver (Author)

2005

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Oliver Blankenstein

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2005

Umfang69 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2005

Genehmigende Fakultät
Fak10

Hauptberichter/Gutachter
Lütticken, Rudolf (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2005-06-20

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-11589
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/62130/files/Blankenstein_Oliver.pdf

Einrichtungen

Medizinische Fakultät (510000-1)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Gruppe-B-Streptokokken (Genormte SW) ; Pathogenitätsfaktor (Genormte SW) ; CAMP (Genormte SW) ; CAMP-Faktor (Genormte SW) ; Protein B (Genormte SW) ; Streptokokken (Genormte SW) ; Streptococcus agalactiae (Genormte SW) ; genetische Determinante (Genormte SW) ; Medizin (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 610

Kurzfassung
Das CAMP-Phänomen der Kohämolyse von Schafserythrozyten in Anwesenheit von beta-Toxin aus Staphylococcus aureus ist eine seit langem bekannte Eigenschaft der Gruppe-B-Streptokokken (Streptococcus agalactiae). Dieses Phänomen wird durch den „CAMP-Faktor” verursacht. Die Charakterisierung, Klonierung und Sequenzierung des für den CAMP-Faktor codierenden cbf-Gens aus Streptococcus agalactiae ist Bestandteil dieser Arbeit. Ausgehend von den von Schneewind et al. klonierten Plasmid pCO63 erfolgte zunächst eine Charakterisierung und Sequenzierung des 3,6 kB großen klonierten Fragments. Es zeigte sich, daß das klonierte Fragment eine CDP-Diglyzerid-Hydrolase aus E. coli beinhaltete, eine eindeutige kohämolytische Aktivität oder ein Ursprung aus chromosomaler Gruppe-B-Streptokokken-DNA konnte nicht nachgewiesen werden. Auf Basis der bekannten Aminosäurensequenz des CAMP-Faktors wurden degenerierte Primer entwickelt, mit deren Hilfe ein Fragment aus dem cbf-Gen kloniert werden konnte. Mit Hilfe der „inverted-PCR” wurden die fehlenden Fragmente amplifiziert, isoliert und kloniert; mit dieser Strategie konnte die gesamte cbf-Gensequenz ermittelt werden. Durch Klonierungsexperimente in temperatursensitiven Expressionssystemen konnte eine eindeutige Kohämolyse des Genprodukts nachgewiesen werden, die sich jedoch nur bei dem gesamten Protein zeigte. Die von uns untersuchten C- und N-terminalen Subfragmente zeigten keine kohämolytische Aktivität. Die Anwesenheit des cbf-Gens wurde in 19 klinischen Isolaten von Streptococcus agalactiae mittels Hybridisierungsexperimenten nachgewiesen. Ein Sequenzvergleich mit dem CAMP-negativem Stamm 47-360 zeigte einige, möglicherweise relevante Mutationen im Promotorbereich.

The CAMP reaction, a synergistic lysis of sheep erythrocytes by Staphylococcus aureus (beta-toxin) and group B streptococci (Streptococcus agalactiae) was first described in 1944 by Christie et al.. This phenomenon is caused by the CAMP-factor, an extra-cellular protein which role pathogenicity and virulence is still unknown. The focus of this work is the molecular isolation and characterization of the CAMP-factor gene of group B streptococci (cbf-Gene). First cloning attempts were made using the plasmid pCO63, which resulted from former work of Schneeewind et al. (1984) and produced a protein which reacted with anti-CAMP serum in western blot analysis. After sequencing of the 3,6 kB insert of that clone we found out that it contained a CDP-gycerol hydrolase of E. coli instead of any GBS-DNA. Further on an internal fragment of the cfb gene from group B streptococcal (GBS) strain R268 was amplified by polymerase chain reaction (PCR) using degenerate primers with sequences derived from the CAMP-factor amino acid (aa) sequence of GBS strain NCTC8181 (Ruhlmann et al., 1988). After cloning and sequencing this fragment, the remainder of cfb and the adjacent 5' and 3' sequences were amplified by inverted PCR of genomic DNA and directly sequenced from the PCR product. Within the 1560 bp sequenced, a complete cfb gene deviating in two deduced aa residues from the published sequence was identified. In addition, the cfbR268 sequence contained a 29-aa leader peptide. Using primers directed to the 5' and 3' ends of cfb for PCR, a cfb gene of uniform size could be detected in 19 clinical GBS isolates including three phenotypically CAMP-negative strains. In the CAMP-negative stain 74-360 a possible mutation in the promoter region were found. The complete cfbR268 gene and different portions of its 5' and 3' ends were cloned into the plasmid pJLA602 and expressed in E. coli DH5 alpha. Only the full-sized recombinant CAMP-factor was found to exert co-hemolytic activity in a sheep-blood agar assay.

OpenAccess:
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