Antikörperfragmente und synthetische Antigene für die Diagnose von Viruserkrankungen der Pflanzen

Uhde, Kerstin; Fischer, Rainer

doi:414

Antikörperfragmente und synthetische Antigene für die Diagnose von Viruserkrankungen der Pflanzen

Uhde, Kerstin (Author)

2002

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Kerstin Uhde

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2002

UmfangIX, 164 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2002

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Fischer, Rainer (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2002-09-20

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-4141
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/62150/files/02_153.pdf

Einrichtungen

Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften (100000)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Biowissenschaften, Biologie (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
In eingelagerten Zuckerrüben ist der Nachweis von Beet necrotic yellow vein virus (BNYVV) durch monoklonale Antikörper oder Antikörper-Fragmente oft problematisch, da der immunodominante C-Terminus des viralen Hüllproteins leicht durch Proteolyse abgespalten werden kann. Mit Hilfe der „Phage display“-Technologie wurden aus zwei naïven, humanen scFv-Bibliotheken scFvs isoliert, die Protease-stabile BNYVV Epitope erkennen. ScFv-Fusionsproteine mit der konstanten Domäne der humanen IgG kappa-leichten Kette (CL) bzw. einer modifizierten alkalischen Phosphatase (AP/S) aus Escherichia coli erlaubten die ELISA Detektion von BNYVV selbst in älteren Zuckerrüben, wobei die Sensitivität mit der von polyklonalen Antikörpern vergleichbar ist. Zwei verschiedene Systeme wurden auf ihre Eignung zur Produktion von diagnostischen Standards in Form von synthetischen Antigenen für den spezifischen Nachweis von BNYVV bzw. Beet soil borne virus (BSBV) getestet. Rekombinante Kartoffelvirus X (rPVX)-Konstrukte, die durch N?terminale Fusion verschiedener BNYVV Epitope hergestellt wurden, riefen in Nicotiana benthamiana systemische Infektionen mit PVX-typischen Symptomen hervor, die sich nicht von denen des PVX Wildtyps unterschieden. Der Nachweis der auf den rPVX-Partikeln präsentierten BNYVV Epitope mit spezifischen mAk war im Western Blot, ELISA sowie durch Immunogoldmarkierung in EM-Untersuchungen erfolgreich. Die Stabilität der in das PVX Hüllprotein (CP) inserierten Fremdsequenzen wurde in einem Langzeitübertragungsexperiment über mehrere Passagen von rPVX auf systemisch infizierten N. benthamiana untersucht. Im Bereich der Fremdsequenz-Insertionen fanden sich Mutationen und Deletionen, die insbesondere positiv geladene AS betrafen und letztendlich dazu führten, dass der anfänglich durch die Epitopinsertion erhöhte isoelektrische Punkt der rekombinanten Hüllproteine so verändert wurde, dass er wieder identisch oder niedriger als der des PVX-CP Wildtyps war. Alternativ zu PVX-Partikeln wurden „virus-like particles“ (VLPs) des Ty1-Retrotransposons aus Hefe zur Herstellung synthetischer Antigene verwendet. Die cytoplasmatische Expression der VLP-Konstrukte war sowohl in Escherichia coli als auch in Pichia pastoris erfolgreich. Die Partikelmorphologie der in E. coli oder P. pastoris produzierten VLPs stimmte mit der von Wildtyp Ty1-VLPs aus Saccharomyces cerevisiae überein. Zusätzlich zu den BNYVV Epitopen wurde auch ein Ty-Konstrukt mit einem im „Peptide display“ isolierten BSBV Epitop erfolgreich cytoplasmatisch in E. coli exprimiert. Dieses auf VLPs präsentierte Epitop konnte wie auch alle BNYVV Epitope im ELISA und im Western Blot mit spezifischen monoklonalen Antikörpern nachgewiesen werden.

The detection of Beet necrotic yellow vein virus (BNYVV) in stored sugar beets by means of monoclonal antibodies or antibody single chain fragments (scFv) often poses problems, because the immunodominant C-terminal epitope of the viral coat protein is readily lost due to proteolysis. Recombinant bacteria which produce scFv specific for protease-stable BNYVV epitopes were selected from two naïve phage display libraries. Fusion proteins of the scFv with a human IgG kappa chain (CL) or with a modified bacterial alkaline phosphatase (AP/S) allow the ELISA detection of BNYVV even in stored sugar beets with a sensitivity comparable to that achieved with polyclonal antibodies. The production of synthetic antigens of BNYVV and Beet soil borne virus (BSBV) for use as diagnostic standards were investigated in two different systems. After N-terminal fusion of different BNYVV epitopes to the coat protein (CP) of Potato virus X (PVX) all recombinant (r)PVX elicited PVX wild-type-specific symptoms on N. benthamiana. Detection of presented BNYVV epitopes with specific monoclonal antibodies was successful in ELISA and Western Blots as well as in immunogold electron microscopy. The stability of the foreign epitope sequences introduced into the PVX CP was studied by means of serial passages on systemically infected N. benthamiana. After five passages mutations and deletions were found in the inserted foreign epitope sequence, especially amino acids with positive charge were affected. Comparison of isoelectric points (pI) and charge of the rCP showed, that the initial high pIs of the rCPs were changed by the observed mutations close to that of wild-type CP. In addition to rPVX particles, “virus-like particles” (VLPs) from the Ty1 yeast retrotransposons were examined for the production of synthetic antigens. Cytoplasmatic expression of VLP constructs was successful in Escherichia coli and in Pichia pastoris. The particle morphology of VLPs produced in E. coli or P. pastoris corresponded with wild-type Ty1-VLPs from Saccharomyces cerevisiae. Apart from BNYVV epitopes also a novel, through peptide phage display identified BSBV epitope was successfully expressed in E. coli. This on VLPs presented BSBV epitope as well as all BNYVV epitopes were detected in ELISA and Western Blots with specific monoclonal antibodies.

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