Identifizierung und Charakterisierung von Homogentisat-Prenyltransferasen aus dem Tocopherol- und dem Plastochinon-9-Biosyntheseweg

Sadre, Radin; Frentzen, Margarete

doi:1793

Identifizierung und Charakterisierung von Homogentisat-Prenyltransferasen aus dem Tocopherol- und dem Plastochinon-9-Biosyntheseweg = Identification and characterization of homogentisate prenyltransferases for tocopherol and plastoquinone-9 biosynthesis

Sadre, Radin (Author)

2006 & 2007

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Radin Sadre

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2006

UmfangX, 153 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2006

Prüfungsjahr: 2006. - Publikationsjahr: 2007

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Frentzen, Margarete (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2006-11-07

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-17931
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/62315/files/Sadre_Radin.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Biowissenschaften, Biologie (frei) ; Vitamin E (frei) ; Homogentisat (frei) ; Prenyltransferasen (frei) ; Tocopherol (frei) ; Plastochinon-9 (frei) ; Substratspezifität (frei) ; Homogentisate (frei) ; Prenyltransferases (frei) ; Plastoquinone-9 (frei) ; substrate specificity (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Tocopherole und Plastochinon-9 sind typische Prenyllipide photosynthetisch aktiver Organismen. Der erste Schritt in der Biosynthese dieser Verbindungen wird durch Homogentisat-Prenyltransferasen katalysiert, die bei Pflanzen in der inneren Hüllmembran der Plastiden lokalisiert sind. Diese Enzyme nutzen Homogentisat vom Shikimat-Weg und Prenylpyrophosphate vom Mevalonat-unabhängigen Isoprenoid-Weg als Substrate und katalysieren die Decarboxylierung und Prenylierung von Homogentisat. Während die Kondensation von Homogentisat mit Phytylpyrophosphat zur Bildung der Tocopherol-Vorstufe führt, entsteht durch die Prenylierung von Homogentisat mit Solanesyl-pyrophosphat die Vorstufe für Plastochinon-9. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden vier Sequenzen für Prenyltransferasen, ein Gen aus Synechocystis sp., zwei cDNAs aus Arabidopsis thaliana und eine cDNA aus Chlamydomonas reinhardtii, kloniert. Die Sequenzen kodieren für hydrophobe Proteine mit wahrscheinlich mehreren Transmembrandomänen. Im Unterschied zum Synechocystis-Enzym verfügen die eukaryoten Proteine zusätzlich über plastidäre Zielsteuerungssequenzen. Die vergleichende Analyse der abgeleiteten Aminosäuresequenzen deckte gemeinsame Motive der Prenyltransferasen auf. Daraus ging auch hervor, dass von den beiden Arabidopsis-Proteinen eines höhere Ähnlichkeit mit dem Synechocystis-Enzym zeigt und das andere höchste Übereinstimmungen mit dem Chlamydomonas-Enzym aufweist. Durch funktionale Expressionsstudien in Escherichia coli gelang es, die katalytische Aktivität der Enzyme in den bakteriellen Membranen nachzuweisen und die Prenyltransferasen hinsichtlich ihrer Eigenschaften zu charakterisieren. Alle Enzyme nutzten spezifisch Homogentisat als Prenylakzeptor, sie unterschieden sich aber in ihren Prenylpyrophosphat-Spezifitäten. Sowohl das Synechocystis- als auch ein Arabidopsis-Enzym erwiesen sich als spezifisch für Phytylpyrophosphat und katalysieren demnach den ersten Schritt im Tocopherol-Biosyntheseweg. Das Chlamydomonas- und das zweite Arabidopsis-Enzym zeigten dagegen höchste Aktivitäten mit Solanesylpyrophosphat und waren mit Phytylpyrophosphat kaum aktiv, was darauf hindeutete, dass diese Prenyltransferasen nicht an der Tocopherol- sondern an der Plastochinon-9-Biosynthese beteiligt sind. Die Funktion des Synechocystis-Enzyms wurde durch die Entwicklung und Analyse einer Synechocystis-Mutante bestätigt, in der das Gen für die Homogentisat-Phytyltransferase durch die Insertion einer Antibiotikum-Resistenzgen-Kassette unterbrochen wurde, was zur vollständigen Inaktivierung der Tocopherol-Synthese führte. Repräsentativ für die eukaryotischen Homogentisat-Prenyltransferasen wurden mit den Arabidopsis-cDNAs Expressionsstudien in transgenen Pflanzen durchgeführt, um Effekte auf die Prenyllipid-Gehalte zu untersuchen. Die Ergebnisse spiegeln die durch Enzymtests ermittelten Substratspezifitäten wider. So ist es durch die Expression der für die Homogentisat-Phytyltransferase kodierenden Sequenz in Kombination mit cDNA-Sequenzen für eine Hydroxyphenylpyruvat-Dioxygenase und eine Cyclase gelungen, den Tocopherol-Gehalt in Samenölen transgener Rapspflanzen auf das 2,4fache zu steigern. Die Überexpression des zweiten Arabidopsis-Gens führte dagegen in transgenen Arabidopsis-Pflanzen zu einer signifikanten Erhöhung des Plastochinon-9-Gehalts, stimulierte aber vermutlich über indirekte Mechanismen auch die Tocopherol-Biosynthese. Diese Daten lieferten somit weitere Hinweise für eine enge Interaktion zwischen den Prenyllipid-Biosynthesewegen in Pflanzen.

Tocopherols and plastoquinone-9 are characteristic prenyllipids of photosynthetic organisms. In plants, the first committed step in the biosynthesis of these compounds is catalyzed by homogentisate prenyltransferases located in the inner envelope membranes of chloroplasts. These enzymes use homogentisate derived from the shikimate pathway and prenyl diphosphates synthesized via the plastidial non-mevalonate isoprenoid pathway as substrates and catalyze the decarboxylation and prenylation of homogentisate. The condensation of homogentisate and phytyl diphosphate provides the precursor for the formation of tocopherols, while prenylation with solanesyl diphosphate results in plastoquinone-9 biosynthesis. Within the scope of the present thesis, four prenyltransferase sequences were cloned, one from Synechocystis sp., two cDNAs from Arabidopsis thaliana and one cDNA from Chlamydomonas reinhardtii. The sequences encode hydrophobic proteins with several putative transmembrane domains. For the eucaryotic proteins, N-terminal plastidial transit peptides were predicted. The alignment of the amino acid sequences revealed conserved prenyltransferase motifs. In addition, these analyses showed that one Arabidopsis protein possesses higher homology to the Synechocystis enzyme whereas the other shares highest similarities with the Chlamydomonas enzyme. By functional expression studies in Escherichia coli, the catalytical activities of these enzymes in bacterial membranes were demonstrated and the prenyltransferases were further characterized. All enzymes accepted homogentisate as substrate but they differed in their prenyl diphosphate specificities. The Synechocystis enzyme as well as one Arabidopsis prenyltransferase specifically utilized phytyl diphosphate as prenyl donor and thus catalyzed the first step in tocopherol biosynthesis. In contrast, the Chlamydomonas enzyme and the second Arabidopsis enzyme reached highest activities with solanesyl diphosphate and were hardly active with phytyl diphosphate indicating that these prenyltransferases are involved in plastoquinone-9 biosynthesis. The in vivo function of the Synechocystis enzyme was confirmed by the development and analysis of a Synechocystis mutant in which the homogentisate prenyltransferase gene was disrupted by the insertion of an antibiotic resistance gene leading to complete inactivation of tocopherol synthesis. In order to study the effects of eucaryotic prenyltransferases on prenyllipid biosynthesis, transgenic plants expressing the Arabidopsis cDNAs were developed. The results are consistent with the substrate specificities determined by enzymic assays. Expression of the homogentisate phytyltransferase gene in combination with genes for hydroxyphenylpyruvate dioxygenase and cyclase resulted in a 2.4 fold increase of tocopherol levels in seed oils of transgenic rapeseed plants in comparison to wild type plants. Overexpression of the second Arabidopsis gene in transgenic Arabidopsis plants led to a significant increase in plastoquinone-9 content but stimulated probably via indirect mechanisms tocopherol biosynthesis, too. Hence, these data provided further indications for a close interaction between the prenyllipid biosynthesis pathways in plants.

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