Einsatz von Pflanzenzellkulturen als industriell nutzbare Expressionssysteme für therapeutische Proteine

Schmale, Kathrin; Fischer, Rainer

doi:1970

Einsatz von Pflanzenzellkulturen als industriell nutzbare Expressionssysteme für therapeutische Proteine = Plant cell cultures as industrial expression systems for therapeutic proteins

Schmale, Kathrin

2007

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Kathrin Schmale

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2007

UmfangIV, 105 S. : graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2007

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Fischer, Rainer (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2007-05-23

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-19701
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/62410/files/Schmale_Kathrin.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Kontinuierliche Fermentation (Genormte SW) ; Kryokonservierung (Genormte SW) ; Humanes Serumalbumin (Genormte SW) ; Biowissenschaften, Biologie (frei) ; BY-2 Kulturen (frei) ; Medienoptimierung (frei) ; rekombinante Proteine (frei) ; Pflanzenzellkulturen (frei) ; Expressionssystem (frei) ; By-2 cultures (frei) ; media optimisation (frei) ; recombinant proteins (frei) ; plant cell cultures (frei) ; expression systems (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
In der vorliegenden Arbeit sollten transgene BY-2 Kulturen hinsichtlich ihres Potenzials als industrielles Expressionssystem für therapeutisch relevante Proteine untersucht werden. Die für diese Zwecke generierte rekombinante BY-2 Kultur exprimierte rekombinantes HSA unter der Kontrolle des CaMV 35SS Promotors. Ein Signalpeptid gewährleistete die Sekretion des Proteins in den Apoplasten. Die für die Industrie entscheidenden Parameter wie Produktivität und genetische Stabilität des Organismus sowie Produktion eines reinen, funktionsfähigen Proteins und die Wirtschaftlichkeit des Produktionsprozesses bilden die Schwerpunkte der hier durchgeführten Untersuchungen. Um die Reproduzierbarkeit von entwickelten und optimierten industriellen Produktionsprozessen gewährleisten zu können, werden i. d. R. Stammkulturen der relevanten Organismen angefertigt. Durch diese Zellbänke wird vor allen Dingen die genetische Stabilität der am Ausgangspunkt eines Produktionslaufs eingesezten Organismen garantiert. Die Lagerung von PZK wird traditionell durch regelmäßige Subkultivierung in Schüttelkolben durchgeführt. Die Zellen werden regelmäßig mit frischem Medium versorgt, so dass ihre Vitalität erhalten bleibt. Bei dieser Art der Stammhaltung konnten Veränderungen hinsichtlich der Expression bzw. Ausbeute der rekombinanten Proteine beobachtet werden. Die Entwicklung von alternativen Lagerungsmöglichkeiten ist somit für die Industrie von entscheidender Bedeutung. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Protokoll zur Langzeitlagerung der transgenen BY-2 Kulturen entwickelt. Die Medienoptimierung stellt in der Prozessentwicklung ein hilfreiches Mittel zur Produktivitätssteigerung der verwendeten Organismen dar. Kommerziell erhältliche Medien sind gerade im Bereich der Pflanzenzellkultivierung veraltet und nicht auf die einzelnen Zelllinien abgestimmt. Dementsprechend zeigt sich hier ein großes Optimierungspotenzial, wie im Rahmen dieser Arbeit exemplarisch gezeigt wurde: Durch Medienoptimierung konnte die Produktivität hinsichtlich des extrazellulär vorliegenden HSA durch die Konzentrationsvariation einer Komponente um den Faktor von 17 verbessert werden. Die Kombination verschiedener produktivitätsfördernder Substanzen führte in den Schüttelkolbenversuchen nicht zu einer Summierung der Verbesserungsfaktoren. Die im Schüttelkolben erzielten Resultate konnten in einen größeren Maßstab (Rührkessel) übertragen werden. Hier erzielte die Kombination zweier produktivitätsfördernder Substanzen eine 20-fache Steigerung der HSA-Akkumulation im Medium. Es ist zu bemerken, dass diese Ergebnisse zwar im Rahmen von am IME durchgeführten Arbeiten mit anderen Proteinen tendenziell und größenordnungsmäßig bestätigt werden konnten (Daten nicht gezeigt), die Datenlage aber eine grundsätzliche Verallgemeinerung auf die Herstellung von rekombinanten Proteinen in PZK noch nicht erlaubt. Die Entwicklung und Optimierung einer Fermentationsstrategie zur effektiveren Produktion rekombinanter Proteine in Pflanzenzellkulturen war ein wesentlicher Bestandteil dieser Arbeit. Untersucht werden sollten hier die verschiedenen Fermentationsstrategien, deren Variationen sowie diverse Prozessparameter. Deutlich wurde, dass zur BY-2 Zellkultivierung industrielle Prozessführungen wie die herkömmliche batch Fermentation aber auch kontinuierliche Fermentationsstrategien angewendet werden können. Ein herausragendes Ergebnis stellt hier die kontinuierliche Fermentation dar: über einen Zeitraum von 50 Tagen konnte täglich eine weitgehend konstante Menge an HSA geerntet werden. Diese Arbeit wurde von der RWTH Graduiertenförderung für wissenschaftlichen Nachwuchs unterstützt.

Within the present thesis transgenic BY-2 cultures should be tested regarding their potential as industrial expression system for therapeutic proteins. For this purpose, BY-2 cultures expressing recombinant HSA under control of the CaMV 35SS promoter were developed. A leader peptide ensured the secretion of the protein to the apoplast. Main focus of the described studies are such parameters, which are of essential importance for the industry, like productivity, genetic stability of the organism as well as the production of a functional protein and the economy of the production process. In general the reproducibility of developed and optimised industrial production processes are ensured by cell stocks of the relevant organisms. Such cell banks guarantee especially the genetic stability of initially used organisms. Traditionally periodic subculturing in shake flasks performs the storing of plant cell cultures. Thus the cells are weekly supplied with fresh medium to maintain their vitality. During this kind of maintenance changes regarding expression and productivity of recombinant proteins could be detected. Hence the development of alternative storing opportunities is of crucial relevance for the industry. Within these studies a protocol for the long-time storage of transgenic BY-2 cultures was developed. In the process development media optimisation is a helpful tool to increase the productivity of the used organisms. Especially for plant cell cultures commercialised media are overaged and not defined for single cell lines. This indicates the enormous room of improvement, which could also be shown within these studies: by variation of the concentration of only one media component the extracellular HSA amount could be increased 17-fold. All results generated during shake flasks trials could be transferred to a larger scale performed in stirred tank bioreactors. The combination of two different enhancing substances did not yield in a summation of the effects during shake flask trials. In stirred tank bioreactors the combination of two enhancing substances increased the productivity by a factor of 20. Even if these results correspond to data, which were generated in other studies performed at the IME (data not shown), a generalization about the production of recombinant proteins in plant cell cultures is not allowed yet. The development and optimisation of a fermentation strategy for the effective production of recombinant proteins in plant cell cultures was an important part of this thesis. Different fermentation strategies, their variations as well as different process parameters should be investigated. All process strategies of industrial interest like the conventional batch fermentation as well as the continuous fermentation were applicable. An outstanding result was the continuous fermentation: during cultivation time of 50 days an extensively constant amount of HSA could be daily harvested. This thesis was supported by the RWTH Aachen Postgraduate Sponsorship for Young Scientists.

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