Auditory brainstem neurons as components of a biohybrid system

Künzel, Thomas; Luksch, Harald

doi:HT015348414

Auditory brainstem neurons as components of a biohybrid system = Neurone des auditorischen Hirnstamms als Komponenten eines biohybriden Systems

Künzel, Thomas^RWTH*

2007

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Thomas Künzel

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2007

Umfang85 Bl. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2007

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Luksch, Harald (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2007-09-25

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-20272
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/62508/files/Kuenzel_Thomas.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Zelldifferenzierung (Genormte SW) ; Neurobiologie (Genormte SW) ; Hirnstamm (Genormte SW) ; Auditorisches System (Genormte SW) ; Zellkultur (Genormte SW) ; Elektrophysiologie (Genormte SW) ; Biokompatibilität (Genormte SW) ; Biowissenschaften, Biologie (frei) ; biohybrid technology (frei) ; potassium channels (frei) ; synaptogenesis (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Neuronale Zellkulturen bieten viele Vorteile für Untersuchungen auf dem Niveau einzelner Zellen und kleiner Netzwerke. Aber ein konzeptionelles Problem bei der Analyse funktioneller neuronaler Schaltkreise in dissoziierten Kulturen ist, dass dem System keine biologische Funktion zugeordnet werden kann. Daher kann keine Vorhersage über die Reaktion des Schaltkreises auf einen bestimmten Eingang gemacht werden. Die Rekonstruktion eines neuronalen Netzwerks in vitro, nach dem Vorbild eines Schaltkreises mit bekannter biologischer Funktion, kann dieses Dilemma lösen. Der Schaltkreis für die Schalllokalisation aus dem auditorischen Stammhirn der Vögel ist ein idealer Modellschaltkreis dafür. Er besteht aus zwei hochspezialisierten Neuronentypen (Nucl. magnocellularis, NM und Nucl. laminaris, NL). Die Embryonalentwicklung dieser Kerngebiete und und ihrer Verschaltung in vivo ist bereits gut untersucht. Diese Studie wurde angefertigt um zu zeigen, dass Neurone aus dem auditorischen Stammhirn des Huhns in Primärkultur gehalten werden können, und um ihre Eigenschaften in vitro zu bestimmen. Damit soll die Grundlage für spätere Versuche, den Schaltkreis als biohybrides System zu rekonstruieren, geschaffen werden. Die Neurone aus NM und NL wurden zu einem frühen Entwicklungszeitpunkt (E6,5) entnommen und für bis zu 15 Tage kultiviert. Die Zellen bildeten Neuritennetzwerke, exprimierten neuronale Markerproteine und waren in dendritische und axonale Kompartimente differenziert. Das Dendritenwachstum konnte mit im micro-contact printing Verfahren erstellten Oberflächenstrukturen gelenkt werden. Darüberhinaus waren die Neurone mit Halbleiter/Metalloxid Oberflächen kompatibel, wenn diese mit einer Proteinbeschichtung versehen waren. Ich konnte zeigen, dass etwa ein Drittel der Neurone Calretinin exprimierten, ein spezifischerer Marker für Neurone des auditorischen Stammhirns. Dies galt für Neurone aus dem Hühnchen, aber auch für solche, die zu äquivalenten Entwicklungsstadien aus dem Gehirn von Schleiereulenembryonen entnommen wurden. Desweiteren wurden in einem kleineren Teil der Neurone spezialisierte spannungsgesteuerte Kaliumkanäle gefunden. Ein signifikante Reifung grundlegender Membraneigenschaften (Ruhepotential, Membranwiderstand, Membrankapazität) konnte durch whole-cell patch Ableitungen festgestellt werden. Dabei wurden Niveaus vergleichbar mit denen in spätembryonalen oder geschlüpften NM/NL erreicht. Zudem zeigten etwa 25% der Neurone Aktionspotentiale (AP) in Mustern, wie sie von Ableitungen von NM/NL in Gehirnschnitten bekannt sind. Es wurden jedoch sowohl dämpfende als auch phasische AP-Muster gefunden, die in vivo frühen und späten Entwicklungszuständen der NM/NL Neurone entsprechen. Dass es sich bei beiden gefundenen Feuertypen um auditorische Neurone handelt, konnte durch Ableitung von fluoreszent vormarkierten NM/NL Neurone bewiesen werden. Die Amplituden der APs und spannungsaktivierter Einwärtsströme, welche in voltage clamp Experimente gemessen wurden, entwickelten sich in vitro hin zu einem reiferen Phänotyp. Diese Ergebnisse deuten an, dass die Reifung neuronaler Funktion ein zellautonom gesteuerter Vorgang in Neuronen des auditorischen Stammhirns des Huhns zu sein scheint. Jedoch ergab eine Analyse der AP Zeitverläufe eine beeinträchtigte Entwicklung spezialisierter Eigenschaften. Dieser Eindruck wurde durch voltage clamp Ableitungen bestätigt werden: obwohl charakteristische spannungsaktivierte Auswärtsströme gefunden wurden und diese sich im Verlauf der in vitro Entwicklung verstärkten, waren die Ströme um etwa eine Größenordnung zu gering. Ich vermute, dass die Einleitung und die Verstärkung der Expression dieser charakteristischen Kanalproteine verschiedene Entwicklungsprozesse in Neuronen des auditorischen Stammhirns sind. Funktionelle Synaptogenese ist eine Voraussetzung für die Rekonstruktion von Schaltkreisen in vitro. Mit verschiedenen Methoden konnte ich zeigen, dass Synaptogenese in der Kultur stattgefunden hat. Synaptische Markerproteine zeigten sich kolokalisiert in punktförmigen Domänen auf Dendriten und Somata der Neurone. Durch funktionelle Darstellung der Vesikelaufnahme ließen sich ebenfalls punktförmige Domänen vergleichbarer Größe darstellen, was auf synaptische Zonen hindeutete. Ableitungen von postsynaptischen Potentialen und Aktionspotentialen nach extrazellulärer Stimulation und Ableitungen von postsynaptischen Mini-Strömen boten weitere Hinweise für synaptische Transmission. Diese Studie zeigt, dass sich die Neuronen des auditorischen Stammhirns der Vögel gut als biologische Komponente eines Biohybridsystem eignen, welches die Prinzipien neuronaler Verschaltung untersuchen soll. Meine Ergebnisse zeigen ausserdem, dass die Differenzierung der NM und NL Neurone von zell-autonomen und aktivitätsregulierten Prozessen bestimmt wird. Eine Langzeituntersuchung der Entwicklung einer biohybriden Version dieses Schalkreises könnte das Verständnis um diese Prozesse verbessern.

Neuronal cell culture systems have many advantages for studies on cellular and smallscale network level. But a conceptual problem in analysing functional neuronal networks in dissociated cultures is, that no biological function can be attributed to the system. Thus, no prediction of the output of the circuit after a given input can be made. This dilemma can be solved with the approach to reconstruct a neuronal network in vitro after a model circuit of known biological function. The sound localisation circuit from the auditory brainstem of birds is an ideal candidate for this. It consist of two neuronal populations (Nucl. magnocellularis, NM and Nucl. laminaris, NL), which are highly specialised in their physiology. The embryonic development of these nuclei and their connections have already been studied in vivo. This study was undertaken to prove that neurons from the auditory brainstem of the chicken can be taken into a primary culture and to characterise their properties in vitro. This knowledge provides the basis for later attempts to reconstruct the NM/NL circuit as a biohybrid system. Neurons from NM and NL were excised at an early stage of development (E6.5) and cultivated for up to 15 days in vitro. The cells in the culture formed networks of neurites, expressed neuronal marker proteins and differentiated into dendritic and axonal compartments. The outgrowth of the neurites could be successfully guided with micro-contact printed protein structures. Moreover, the neurons were compatible with metal/semiconductor surfaces as culture substrate, if coated with protein. I could show that about one third of the neurons expressed calretinin, a more specific marker of auditory brainstem neurons. This was true for neurons from the chicken as well as barn owl brain of corresponding developmental stages. Also, a smaller amount of neurons were found to be positive for specialised voltage gated potassium channels. A significant maturation of basic membrane properties (resting membrane potential, membrane resistance, membrane capacity) could be determined in whole-cell patch experiments. Levels comparable to that in late embryonic/hatch neurons of NM/NL were reached. About 25% of the neurons showed action potential (AP) firing patterns similar to those seen in NM/NL in slice recordings. However, damper as well as true phasic firing types were found, which can be attributed to early and late developmental states of NM/NL neurons. It was proven by prelabeling of NM/NL neurons with fluorescent tracers, that neurons of those firing types in the culture are of auditory origin. AP amplitudes and voltage activated inward currents recorded in voltage clamp experiments developed towards a mature phenotype in vitro. These data suggest, that the general maturation of neuronal function is an cell-autonomous process in the auditory brainstem neurons of the chicken. However, a detailed analysis of the temporal dynamics of APs revealed impaired development of specialised features. This was corroborated in voltage clamp recordings. Though characteristic voltage-activated outward currents were found and did increase during in vitro development, the currents were an order of magnitude too low. I suppose that initiation and strengthening of expression of these characteristic channel proteins are different developmental processes in the auditory brainstem neurons. Functional synaptogenesis is a prerequisite for the reconstruction of in vitro circuits. With a variety of methods I could prove that synaptogenesis took place in the culture. Synaptic marker proteins were colocalised in punctiform domains on dendrites and somata of the neurons. A functional imaging of vesicle uptake with styryl dyes revealed punctiform domains of similar size, indicating synaptic zones. Recordings of excitatory postsynaptic potentials and APs after extracellular stimulation and recordings of miniature excitatory postsynaptic currents provided further evidence for synaptic transmission between neurons in the culture. This study demonstrates that the neurons from the avian auditory brainstem circuit are well suited as the biological component of a biohybrid system to analyse principles of neuronal connectivity. My results also show the differentiation of NM and NL neurons to be determined by cell-autonomous and activity-regulated processes. More insight could be provided with long-term examination of the development of the biohybrid in vitro version of the circuit.

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