Entwicklung eines Enzym-Modul-Systems zur Synthese und in situ Regeneration von dTDP-aktivierten Desoxyzuckern

Rupprath, Carsten; Elling, Lothar

doi:urn:nbn:de:hbz:82-opus-20641

Entwicklung eines Enzym-Modul-Systems zur Synthese und in situ Regeneration von dTDP-aktivierten Desoxyzuckern = Development of an Enzyme Module System for the synthesis and in situ regeneration of dTDP-activated deoxysugars

Rupprath, Carsten (Author)

2007

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Carsten Rupprath

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2007

Umfang319 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2007

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Elling, Lothar (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2007-08-27

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-20641
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/62552/files/Rupprath_Carsten.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Glycosyltransferasen (Genormte SW) ; Kombinatorische Synthese (Genormte SW) ; Biokatalyse (Genormte SW) ; Heterologe Genexpression (Genormte SW) ; Makrolidantibiotikum (Genormte SW) ; Biowissenschaften, Biologie (frei) ; glycosyltransferase (frei) ; combinatorial biocatalysis (frei) ; enzymatic synthesis (frei) ; heterologuos genexpression (frei) ; antibiotics (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
In dieser Arbeit war es erstmalig möglich, glykosylierte Naturstoffe in vitro durch in situ Regeneration von dTDP-aktivierten Desoxyzuckern herzustellen. Die von EU-Projektpartnern erhaltenen Desoxyzuckerbiosynthesegene aus dem Avilamycin- (AviS, AviT), Urdamycin- (UrdR) und Midekamycin-Biosynthesecluster (MidC, MidH und MidK) für die enzymatische Synthese NDP-aktivierter Desoxyzucker erwiesen sich bei der Expression in E. coli bzw. S. lividans (MidK) als schwerlöslich (inclusion bodies). Nach einer umfangreichen Expressionsoptimierung konnten alle Gene löslich exprimiert und im 10-20-L-Maßstab fermentiert und aufgereinigt werden. Allerdings zeigten weder die Enzympaare AviS/AviT/UrdR noch MidC/MidH/MidK eine Aktivität. Für die Synthesen von dTDP-6-Desoxy-4-keto-D-glucose und von dTDP-L-Rhamnose wurden die Enzyme dTMP-Kinase, SuSy, RmlB, RmlC-His und RmlD-His im 10-20-L-Maßstab fermentiert und präparativ aufgereinigt. Die Aufreinigung von RmlC- und RmlD-His wurde durch Fusion mit einem His-Tag deutlich erleichtert, da ein einziger IMAC-Schritt für die Produktion von hochreinem Enzym ausreichte. Die präparative Synthese der dTDP-L-Rhamnose, ausgehend von den preiswerten Substraten dTMP und Saccharose, wurde mit den hochaufgereinigten Enzymen RmlC und RmlD deutlich beschleunigt und es konnte sehr ökonomisch die bisher größte Menge an dTDP-L-Rhamnose produziert werden (~200 mg). Die Glykosyltransferase SorF aus dem Sorangicin Biosynthesecluster von Sorangium cellulosum So ce 12 katalysiert den Transfer von NDP-aktivierten Zuckern auf das Aglykon Sorangicin A. Nach einer 10-L-Fermentation und affinitätschromatographischer Aufreinigung des Enzyms wurde ein Aktivitätstest entwickelt und das pH- sowie Temperaturoptimum von SorF bestimmt. Mit einer Gelfiltration konnte das native Molekulargewicht bestimmt werden und es wurde festgestellt, dass das Enzym als Monomer vorliegt. Die Bestimmung des Substratspektrums von SorF ergab eine außergewöhnliche Substratpromiskuität. Nicht nur das natürliche Produkt Glucosyl-Sorangiosid, sondern auch die neuartig glykosylierten Sorangioside 6-Desoxy-4-keto-glucosyl-Sorangiosid, Galactosyl-Sorangiosid, Xylosyl-Sorangiosid und Rhamnosyl-Sorangiosid wurden erstmalig produziert und per DC-, CE- und HPLC-MS-Analytik nachgewiesen. Aufgrund der Übertragung von dTDP-L-Rhamnose und UDP-/dTDP-aktivierten-D-Zuckern gehört SorF zu den in vitro sehr seltenen D- und L-Zucker-akzeptierenden Glykosyltransferasen. Darüber hinaus wurde SorF mit den Substraten dTDP-6-Desoxy-4-keto-D-glucose, dTDP-D-Glucose, UDP-D-Glucose und dTDP-L-Rhamnose kinetisch charakterisiert. Mit SorF und den zuvor für die Synthese von dTDP-aktivierten Desoxyzuckern verwendeten Enzymen konnte ein Enzym-Modul-System (EMS) entwickelt werden. Das EMS erlaubte erstmals die in vitro Herstellung eines glykosylierten Naturstoffes mit in situ Regeneration des Nukleotidzuckers. Durch Kombination von SuSy mit SorF konnte Glucosyl-Sorangiosid mit ca. 10 Zyklen (von max. 10) produziert werden. Außerdem konnten SuSy, RmlB, RmlC-His, RmlD-His und SorF zur in situ Synthese von Rhamnosyl-Sorangiosid kombiniert werden. Die dTDP-L-Rhamnose wurde über sechsmal recycliert, wobei auch noch etwas Glucosyl-Sorangiosid produziert wurde, da dTDP-D-Glucose ein besseres Substrat für SorF ist als die dTDP-L-Rhamnose. Auch die zusätzliche in situ Recyclierung des NADH mit der Formiat-Dehydrogenase für die 4-Ketoreduktase RmlD war im EMS möglich und verschlechterte die Ausbeute an Rhamnosyl-Sorangiosid kaum. Die Etablierung des EMS ermöglicht außerdem die schnelle Charakterisierung von Glykosyltransferasen (Substratpromiskuität) durch einfachen Austausch der Enzyme im Desoxyzucker-Modul oder der Aglyka. Darüber hinaus können hybrid glykosylierte Naturstoffe ohne aufwändige Synthese und Aufreinigung der dTDP-aktivierten Zucker mit einer solchen in situ Eintopfsynthese produziert werden. Um die Handhabung des EMS weiter zu vereinfachen, wurden die am EMS beteiligten Enzyme mit Ni-NTA-Magnet-Beads immobilisiert und auf Aktivität untersucht. Dabei zeigten die immobilisierten Enzyme RmlC-His/RmlD-His im Fotometer eine deutliche Aktivität. Aufgrund von Nachteilen der kommerziellen Magnet-Separatoren wurde ein neuer Magnet-Separatortyp (MAGICA-Separator) für die kontinuierliche Messung im Mikrotiterplattenfotometer entwickelt und zum Patent angemeldet. Er ermöglicht erstmals die kontinuierliche Messung von immobilisierten Enzymen im Mikrotiterplattenfotometer und erlaubt damit auch die kinetische Charakterisierung der Enzyme. Die Aktivität der Enzyme RmlC-His/RmlD-His, dTMP-Kinase und SuSy wurde mit dem MAGICA-Separator im immobilisierten Zustand gemessen und die dTMP-Kinase und SuSy auch kinetisch charakterisiert. Auch die Kombination mehrerer Enzyme (dTMP-Kinase und SuSy) im immobilisierten Zustand war möglich und es konnte eine Aktivität gemessen werden.

The results of this thesis showed for the first time that it is possible to produce glycosylated natural compounds in vitro with in situ regeneration of dTDP-activated deoxysugars. The deoxysugar biosynthesis genes from the avilamycine- (aviS, aviT), urdamycine- (urdR) and midekamycine-biosynthesis cluster (midC, midH and midK) provided by the EU-project partners for the enzymatic synthesis of dTDP-activated deoxysugars were insoluble (inclusion bodies) during expression in E. coli or S. lividans (midK). After an extensive optimization all genes could be expressed solubly, fermented in a 10-20-L-scale and purified. But neither the enzyme pairs AviS/AviT/UrdR nor MidC/MidH/MidK showed any activity. The enzymes dTMP-kinase, SuSy, RmlB, RmlC-His and RmlD-His were fermented (10-20-L-scale) and purified preparatively for the syntheses of dTDP-6-deoxy-4-keto-D-glucose and dTDP-L-rhamnose. The purification of RmlC and RmlD was considerably improved by fusion with a His-Tag because a single IMAC step was sufficient for the production of pure enzyme. The preparative synthesis of dTDP-L-rhamnose starting with the inexpensive substrates dTMP and sucrose was noticeably accelerated by the highly purified enzymes RmlC and RmlD and the so far biggest amount of dTDP-L-rhamnose was produced very economically (~200 mg). The glycosyltransferase SorF from the Sorangicin biosynthesis cluster of Sorangium cellulosum So ce 12 catalyzed the transfer of NDP-activated sugars on the aglycon sorangicin A. After a 10-L-fermentation and an affinity-tag purification of the enzyme, an activity assay was developped and the pH- and temperature-optimum of SorF were determined. The native molecular weight and the monomeric occurrence of SorF were determined by gelfiltration. The measured substrate spectrum of SorF was extraordinary. The natural product glucosyl-sorangioside and the novel glycosyltated sorangiosides 6-deoxy-4-keto-glucosyl-sorangioside, galactosyl-sorangioside, xylosyl-sorangioside and rhamnosyl-sorangioside were produced for the first time and confirmed by TLC-, CE- and HPLC-MS-analysis. SorF belongs to the in vitro very rare D- and L-sugar accepting glycosyltransferases because of the transfer of dTDP-L-rhamnose and UDP-/dTDP-activated-D-sugars. Additionally, SorF was kinetically characterized with the substrates dTDP-6-deoxy-4-keto-D-glucose, dTDP-D-glucose, UDP-D-glucose and dTDP-L-rhamnose. An enzyme module system (EMS) was developped by combining SorF with the previously used enzymes for the synthesis of dTDP-activated deoxysugars. The EMS made it possible for the first time to produce glycosylated natural compounds in vitro with in situ regeneration of the nucleotide sugar. By combining SuSy with SorF in the EMS, glucosyl-sorangioside was produced with 10 cycles (out of max. 10). Additionally, SuSy, RmlB, RmlC-His, RmlD-His and SorF could be successfully combined in an EMS for the in situ synthesis of rhamnosyl-sorangioside. The dTDP-L-rhamnose was recycled more than six times although some glucosyl-sorangioside was also produced because dTDP-glucose is a better substrate for SorF than the dTDP-L-rhamnose. Moreover, the additional in situ regeneration of NADH with the formate-dehydrogenase was possible and hardly decreased the yield of rhamnosyl-sorangioside. The development of the EMS allows as well the fast characterization of glycosyltransferases (substrate promiscuity) by simple exchange of the aglycons or the enzymes in the deoxysugar module. Additionally, hybrid glycosylated natural compounds can now be produced without costly synthesis and time-consuming isolation of dTDP-activated sugars by an in situ one-pot synthesis. For further improvement of the handling, the EMS participating enzymes were immobilized and the activity determined. The immobilized enzymes RmlC-His/RmlD-His showed a clear activity in the photometer. Disadvantages of the commercially available magnetic separators led to the development of a new type of magnetic separator (MAGICA-separator) for the continuous measurement in the microplate reader (applied for patent). The MAGICA-separator allowed for the first time the continuous measurement of immobilized enzymes in the microplate reader and moreover the kinetic characterization was possible. The activity of the immobilized enzymes RmlC-His/RmlD-His, dTMP-Kinase and SuSy was determined with the MAGICA-separator, and the dTMP-kinase and SuSy were also kinetically characterized. Additionally, the combination of several immobilized enzymes was possible and led to the measurement of an activity which was a first step towards an immobilized EMS.

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