Das Interaktom der SH2-Domänen der Proteintyrosinphosphatase SHP2 und ihren krankheitsrelevanten Mutanten

Müller, Jutta Pia; Schaper, Fred

doi:32035

Das Interaktom der SH2-Domänen der Proteintyrosinphosphatase SHP2 und ihren krankheitsrelevanten Mutanten = Interactome of the SH2 domains of the protein tyrsoine phosphatase SHP2 and its disease-relevant mutants

Müller, Jutta Pia

2011 & 2012

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Jutta Pia Müller

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2011

UmfangII, 169 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2011

Prüfungsjahr: 2011. - Publikationsjahr: 2012

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Schaper, Fred (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2011-09-30

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-38152
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/63119/files/3815.pdf

Einrichtungen

Lehrstuhl für Biochemie und Molekularbiologie (513000-2)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Proteintyrosinphosphatase (Genormte SW) ; Wechselwirkung (Genormte SW) ; Biowissenschaften, Biologie (frei) ; Interaktom (frei) ; SHP2 (frei) ; PTPN11 (frei) ; Mutanten (frei) ; interactome (frei) ; mutants (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570
rvk: WB 1036

Kurzfassung
Die Proteintyrosinphosphatase (PTP) SHP2 ist ein bekannter Regulator von Wachstumsfaktor- und Zytokin-induzierten Signalwegen. Sie ist aus zwei SH2-Domänen, einer katalytisch aktiven PTP-Domäne und einem C-terminalen Bereich mit phosphorylierbaren Tyrosylseitenketten aufgebaut. SHP2 kann als Adapter und als Phosphatase Einfluss auf Signalwege nehmen. Durch den modularen Aufbau sind die Reaktions- und Regulationsmechanismen komplex und beinhalten unter anderem einen Autoinhibitionsmechanismus, bei dem die N-terminale SH2-Domäne die Bindungsstelle der PTP-Domäne intramolekular blockiert. Die SH2-Domänen können abhängig von phosphorylierten Tyrosylresten in anderen Proteinen mit diesen interagieren. Zu Beginn der Arbeit waren nur wenige Bindungspartner von SHP2 bekannt. Deshalb wurden hier massenspektrometrische Experimente zur Identifizierung der Interaktionspartnerder beiden SH2-Domänen etabliert. Hierfür wurden die beiden SH2-Domänen heterolog in Bakterien als GST-Fusionsproteine exprimiert, aufgereinigt und nach der Kopplung an magnetische Beads zur Präzipitation der interagierenden Proteine aus Lysaten von metabolisch, mit stabilen Isotopen von Aminosäuren markierten Zellen verwendet. Das so gewonnene Interaktom der SH2-Domänen umfasst mehr als 1000 Proteine aus unterschiedlichen Signalwegen. Keimbahn- und somatische Mutationen im SHP2 codierenden Gen PTPN11 wurden in Patienten mit Noonan Syndrom, Leukämien und Melanomen identifiziert. Im Allgemeinen wurde als Ursache der Krankheiten eine gestörte Autoinhibition von SHP2 durch die Punktmutationen angenommen. Da so aber nicht alle molekularen Effekte erklärt werden konnten, wurden im Rahmen dieser Arbeit auch mutierte SH2-Domänen untersucht. Es wurden Mutationen gewählt, die nicht nur in der Interaktionsfläche der N-terminalen SH2- und der PTP-Domäne liegen, sondern auch innerhalb oder in der Nähe der Bindungstaschen der SH2-Domänen. Zunächst wurde die Bindung der Mutanten an Peptide bekannter Interaktionspartner mittels Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) analysiert und veränderte Bindungseigenschaften der Mutanten gezeigt. Im Anschluss daran wurde das Interaktom der mutierten SH2-Domänen massenspektrometrisch analysiert und auch global veränderte Bindungseigenschaften der ausgewählten Punktmutanten gezeigt. Diese Bindungseigenschaften könnten sich neben der veränderten Funktion als Adapter bei Rekrutierung von Proteinen auch direkt auf die Aktivität der Phosphatase gegenüber Zielproteinen auswirken und somit eine weitere Erklärung für die Krankheiten liefern.

The protein tyrosine phosphatase SHP2 is a common regulator of cytokine, growth factor signaling and has been shown to influence cell survival, proliferation and differentiation by regulation of MAP Kinase, Jak/STAT and PI3K pathways. Structurally SHP2 consists of two SH2 domains, a catalytically active PTP domain and tyrosine residues in the C-terminal tail which upon phosphorylation interact with SH2 domain containing proteins. In addition to its enzymatic function, the protein is also capable of exerting functions as an adaptor molecule. An optional intramolecular interaction of the N-terminal SH2 with the phosphatase domain is able to block the catalytic cleft sterically. Thereby the entry of substrates can be prevented. Due to the auto-inhibition, and the variety of interactions with other proteins which also influence the activity of SHP2, its regulation is complex. Since little is known about the interaction partners of SHP2, this projects aims to identify novel interaction partners using stable-isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) combined with mass spectrometry. SH2 domains were expressed as GST-fusion proteins in bacteria, subsequently coupled to magnetic beads and used for precipitation of interaction partners from cell lysates. The identified interactome comprises of more than 1000 proteins from different signaling pathways. Germline and somatic mutations in PTPN11 are known be involved in several diseases like Noonan or LEOPARD syndrome or leukemia. Several of these mutations show altered enzymatic activity due to changed auto-inhibition but not all disease patterns can be explained by this observation. Hence, this study also aims to analyze the binding capacities of different disease relevant SHP2 mutants in the SH2 domains. The residues affected in the investigated mutants are not only located in the area responsible for the interaction of the N-terminal SH2 domain with the PTP domain but also the peptide binding area of the SH2 domains. Surface plasmon resonance reveals that the latter mutants show different binding properties to receptor peptides when compared to wild type. Furthermore, the altered binding can also be observed when using proteins precipitated from lysates that are analyzed by mass spectrometry. These observed binding properties might directly translate to altered, recruitment-dependent enzyme activity on target proteins and thereby explain disease patterns.

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