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000064552 1001_ $$0P:(DE-82)135274$$aSchulte, Wibke Karin$$b0$$eAuthor
000064552 245__ $$aD-Dopachrome tautomerase (D-DT) : functional homologue or cross-regulator of macrophage migration inhibitory factor (MIF)?$$cvorgelegt von Wibke Karin Schulte$$honline, print
000064552 246_3 $$aD-Dopachrom Tautomerase (D-DT) : ein funktionelles Homolog oder ein Gegenregulator von Macrophage Migration Inhibitory Factor (MIF)?$$yGerman
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000064552 500__ $$aZsfassung in dt. und engl. Sprache. - Prüfungsjahr: 2011. - Publikationsjahr: 2012
000064552 520__ $$aMacrophage migration inhibitory factor (MIF) is a pleiotropic immunoregulatory and pro-inflammatory cytokine, which plays a pivotal role in the pathogenesis of various acute and chronic inflammatory diseases. For example, endotoxemia studies in mice reveal that MIF administration decreases the survival rate, whereas MIF neutralization or genetic deletion of Mif improve the chances for a beneficial outcome. Additionally, high MIF levels are measured in a variety of human tumors and functional studies reveal MIF involvement in multiple aspects of tumor progression including control of cell proliferation and prevention of apoptosis. Unlike other cytokines, MIF also is a phenylpyruvate tautomerase that converts two non-physiologic enzymatic substrates, D-dopachrome and p-hydroxyphenylpyruvate (HPP). To date, possible relationships between the tautomerase and inflammatory or tumor-supportive activities of MIF remain unclear. In 1993, D-dopachrome tautomerase (D-DT) was discovered during an investigation of melanogenesis. The tertiary structure of D-DT is remarkably similar to MIF, identifying D-DT as the only known eukaryotic MIF homologue discovered to date. D-DT shares MIF’s tautomerase activity and, thus, both proteins are members of the MIF tautomerase superfamily. Despite D-DT’s intriguing similarities to the very well studied MIF, there have been very few reports on the biological functions and mechanisms of action of D-DT. This thesis aimed at the functional characterization of D-DT in biological and pathophysiologic conditions. Prior to apoptotic studies, D-DT cDNA was cloned into a mammalian expression vector, cells were transfected with the newly generated plasmid and protein overexpression confirmed. Successive data demonstrated that D-DT did not obtain anti-apoptotic effects upon nitric oxide-induced apoptosis in macrophages. For the first time, this suggested contrary effects of D-DT in comparison to MIF. In a subsequent cell survival study of D-DT it was illustrated that D-DT enhanced macrophage viability to a more pronounced extent than MIF. Interestingly, it was further shown that simultaneous treatment of cells with MIF and D-DT increased macrophage viability even more, which suggested additive effects of both proteins. Additionally, D-DT was characterized as a protein that tautomerizes the substrate HPP and, thus, possessed analog enzymatic activity to MIF. However, quantitative differences in the tautomerization rate became evident between different mammalian homologues of D-DT. The covalent MIF inhibitor 4-IPP also inhibited the tautomerase activity of D-DT, whereas D-DT was not susceptible to ISO-1. This thesis also demonstrated first insight into D-DT’s in vivo role in a murine model of endotoxic shock. Neutralization of D-DT had a protective effect in the LPS-shock model. This finding accorded with results reported for MIF and, therefore, suggested analog functions of D-DT in this context. Taken together, this thesis reports on mostly similar, but also contrary biologic functions of MIF and D-DT. As this study is one of the first approaches to determine D-DT’s role in disease, continuative investigations need to be conducted to further validate these observations. Recent studies showed that the deletion of the MIF receptor, CD74, abrogates downstream MIF effects to a greater extend than MIF deficiency alone. My work also indicates the importance of further studies to determine D-DT’s potency as a MIF receptor ligand.$$leng
000064552 5203_ $$aMacrophage migration inhibitory factor (MIF) ist ein pleiotropes immunregulatorisches und proinflammatorisches Zytokin, welches eine entscheidende Rolle in der Pathogenese diverser akuter und chronischer Entzündungsprozesse einnimmt. Beispielsweise zeigen Studien des endotoxischen Schocks, dass die Applikation von MIF die Überlebensrate von Mäusen vermindert, während die MIF-Neutralisation oder die genetische Deletion von Mif vor der Endotoxämie schützt und das Überleben der Mäuse stärkt. Erhöhte MIF-Konzentrationen werden in verschiedenen menschlichen Tumoren gemessen und funktionelle Studien zeigen einen Einfluss von MIF auf die Tumorprogression, z.B. auf die Regulation der Zellvermehrung und der Verhinderung des Zelltodes. Im Gegensatz zu anderen Zytokinen besitzt MIF außerdem eine Tautomerase-Aktivität, mit der MIF die nicht-physiologischen Substrate D-Dopachrom und p-Hydroxyphenylpyruvat (HPP) enzymatisch umsetzt. Bisher ist kein überzeugender Zusammenhang zwischen der Tautomeraseaktivität von MIF und seinen inflammatorischen und tumorfördernden Wirkungen beschrieben worden. Im Jahre 1993 wurde D-Dopachrom Tautomerase (D-DT) bei einer Untersuchung der Melanogenese entdeckt. Die Tertiärstrukturen von D-DT und MIF sind bemerkenswert ähnlich, wodurch D-DT das bisher einzige eukaryotische Homolog von MIF darstellt. D-DT besitzt eine MIF-ähnliche Tautomeraseaktivität. Obwohl D-DT eine erhebliche Ähnlichkeit zu dem viel erforschten MIF aufweist, wurden bisher wenige Studien zu D-DTs biologischer Funktion veröffentlicht. Ziel dieser Arbeit war es, das Protein D-DT auf mögliche biologische und pathophysiologische Wirkungen weitergehend zu charakterisieren. Zunächst wurde daher D-DT cDNS in einen Expressionsvektor kloniert, Zellen mit diesem transfiziert und die Proteinüberexpression bestätigt. Nachfolgend konnte gezeigt werden, dass D-DT anders als MIF nach Stickstoffmonoxid-induzierter Apoptose keine anti- apoptotische Wirkung auf Makrophagen besitzt. Zum ersten Mal beschreibt dies einen gegensätzlichen Effekt von D-DT in Bezug auf MIF. In einer Untersuchung des Überlebens von Makrophagen wurde gezeigt, dass D-DT die Lebensfähigkeit der Zellen stärker förderte als MIF. Interessanterweise war zu beobachten, dass die simultane Stimulation der Immunzellen mit MIF und D-DT deren Lebensfähigkeit noch weiter erhöhte, was auf additive Effekte beider Proteine hindeutete. Weitergehend konnte im Rahmen dieser Arbeit bestätigt werden, dass D-DT das Substrat HPP tautomerisierte und daher eine analoge enzymatische Aktivität zu MIF besitzt. Allerdings bestanden quantitative Unterschiede in der Tautomeraserate zwischen verschiedenen mammalischen D-DT Homologen. Der kovalente MIF-Inhibitor 4-IPP inhibierte ebenfalls die Tautomeraseaktivität von D-DT, wo hingegen D-DTs enzymatische Aktivität durch ISO-1 nicht inhibierbar war. Des Weiteren gewährt diese Arbeit erste Einblicke in die in vivo-Rolle von D-DT in einem murinen endotoxischen Schockmodell. Die Neutralisation von D-DT mit einem Antikörper schützte vor den letalen Folgen des LPS-induzierten septischen Schocks. Diese Beobachtung stimmte mit vorherigen Studien von Funktionen von MIF überein und lässt daher auf analoge Funktionen von D-DT und MIF in der septischen Pathogenese schließen. Zusammenfassend beschreibt diese Arbeit einerseits vergleichbare Effekte von MIF und D-DT, allerdings wurden auch gegensätzliche Wirkungen deutlich. Da dies eine der ersten Studien zu D-DTs Rolle bei Krankheitsprozessen darstellt, ist es wichtig nachfolgende Untersuchungen durchzuführen, um diese Ergebnisse weitergehend zu verifizieren. Kürzliche Studien zeigten außerdem, dass die Deletion des MIF-Rezeptors CD74, MIF-Effekte stärker aufhebt als die Neutralisation von MIF alleine. Meine Arbeit legt also auch weitere Untersuchungen nahe, in denen die Potenz von D-DT als Ligand der MIF-Rezeptoren untersucht werden sollte.$$lger
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