Development of a flow cytometer-based in vitro compartmentalization screening platform for directed protein evolution

Körfer, Georgette Dorothea Johanna; Schwaneberg, Ulrich; Elling, Lothar

doi:35508

Development of a flow cytometer-based in vitro compartmentalization screening platform for directed protein evolution = Entwicklung einer zellfreien Durchflusszytometrie-Durchmusterungsplattform für die Gelenkte Proteinevolution

Körfer, Georgette Dorothea Johanna^RWTH*

2016

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Master of Science (M. Sc.) Biologie Georgette Körfer (geb. Wirtz)

ImpressumAachen 2016

Umfang1 Online-Ressource (X, 212 Seiten) : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, RWTH Aachen University, 2016

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Schwaneberg, Ulrich (Thesis advisor)^RWTH* ; Elling, Lothar (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2016-07-26

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-rwth-2016-060015
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/661859/files/661859.pdf
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/661859/files/661859.pdf?subformat=pdfa

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
directed evolution (frei) ; cell-free protein production (frei) ; cellulase (frei) ; flow cytometry (frei) ; ultrahigh throughput screening (frei) ; (w/o/w) emulsion (frei) ; phytase (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Die Gelenkte Evolution von Proteinen ist eine leistungsfähige Methode zur Entwicklung industriell relevanter Biokatalisatoren. In den letzten 10 Jahren ermöglichten methodologische und konzeptionelle Fortschritte in der Gelenkten Evolution die Maßschneiderung von Enzymen für unnatürliche Substrate mit katalytischen Effizienzen über die der natürlichen Enzyme hinaus. Trotz des Fortschritts auf dem Gebiet der Gelenkten Evolution sind die Möglichkeiten zur Erforschung der generierbaren Sequenzvielfalt, sowie die Beschleunigung wiederholter Zyklen von Mutagenese und Durchmusterung, mit den gängigen, heutzutage verwendeten Durchmusterungstechnologien noch immer sehr begrenzt. Nach dem heutigen Stand der Technik stellt die Entwicklung eines Hochdurchsatz-Durchmusterungsverfahrens die größte Herausforderung in der Gelenkten Evolution von Proteinen dar und würde, im Gegensatz zu Durchmusterungsverfahren mit mittlerem Durchsatz, unter Verwendung der Durchflusszytometrie eine zügige Analyse von bis zu 10^7 Ereignissen pro Stunde ermöglichen. Die Möglichkeit Millionen von Varianten innerhalb eines Tages mittels uHTS-Technologie zu analysieren ermöglicht die Erstellung von Bibliotheken mit hoher Mutationsrate und eröffnet damit die Möglichkeit zur Untersuchung von Struktur-Funktions-Beziehungen oder kombinatorischen Effekten im Zuge Gelenkter Evolutionskampagnen. Letzteres ist bis heute mit gängigen Durchmusterungsmethoden aus Zeit- und Kostengründen in Gelenkten Evolutionskampagnen noch nicht durchführbar. Die meisten publizierten Hochdurchsatzdurchmusterungssysteme setzten Zell-basierte in vivo Durchmusterungsstrategien ein, in welchen die bakterielle Wirtszelle als Träger für die Enzym-Varianten genutzt wird. Die Haupteinschränkung der Zell-basierten Systeme liegt in der geringen Transformationseffizienz, welche in reduzierter Gen-Diversität resultiert. In dieser Arbeit wurde eine Hochdurchsatzdurchmusterungsplattform entwickelt, in welcher Zellen durch eine zellfreie Transkriptions-Translations-Maschinerie ersetzt wurden, welche in künstliche Zell-ähnliche Kompartimente, sogenannte Wasser-in-Öl-in-Wasser (w/o/w) Emulsionen enkapsuliert wurde. In jedes Emulsionskompartiment wird dabei jeweils eine einzelne Kopie eines Gens einer hoch diversen Genbibliothek (10^8) eingeschlossen. Im Zuge der zellfreien Transkription und Translation der Gene, die für aktive Enzymvarianten kodieren, werden die Kompartimente, durch die Umsetzung des fluorogenen Substrates in das fluoreszente Produkt, markiert und können mittels Durchflusszytometer analysiert werden. In vitro Kompartimentalisierung ermöglicht die Erhaltung der Genotyp-Phänotyp Kopplung und die Isolation von Genen, die für aktive Enzymvarianten kodieren, aus einem Überschuss an Genen, die für inaktive Enzymvarianten kodieren. Die Hochdurchsatzdurchmusterungsplattform wurde für Zellulase (CelA2) entwickelt und basiert auf der in vitro Produktion des CelA2-Enzyms innerhalb von (w/o/w) Emulsionen und auf der Umsetzung des Substrat/Produkt Paares Fluorescein-di-beta-D-cellobiosid/Fluorescein (Ex.: 494 nm/Em.: 516 nm). Die entwickelte zellfreie Hochdurchsatzdurchmusterungsplattform wurde über die Durchmusterung einer epPCR Zellulase Zufallsmutagenese-Bibliothek validiert aus welcher innerhalb von nur zwei Wochen bereits eine verbesserte Variante hervorging. Die identifizierte Variante CelA2-H288F-M1 (N273D/N468S) zeigte einen 5-fach reduzierten KM-Wert und eine 13,3-fach erhöhte spezifische Aktivität (220,60 U/mg) im Vergleich zum Zellulase Wildtyp (16,57 U/mg). Die Durchflusszytometer-basierte zellfreie Hochdurchsatzdurchmusterungsplattform wurde des Weiteren eingesetzt um Unterschiede zwischen drei gezielten Mutantenbibliotheken, basierend auf iterativer und simultaner Sättigungsmutagenese (z.B. OmniChange) von vier Aminosäure-Positionen, zu erforschen und kombinatorische Effekte zu untersuchen. Die beste Variante enthielt nur zwei Aminosäuresubstitutionen (F288 und Q524) und zeigte eine 8-fache Verbesserung der spezifischen Aktivität im Vergleich zur Ursprungsvariante. Zur Erweiterung der Plattform auf andere Enzyme wurde in dieser Arbeit zusätzlich ein in vitro-basierter Durchmusterungstest für den Yersinia mollaretii Phytase Wildtyp (YmPhWT) optimiert. Auf Grund der unterschiedlichen pH-Optima der zellfreien Expressionsmaschinerie (pH 7) und der sauren Phytase wurde eine Optimierung des YmPhWT durch eine Gelenkte Evolutionskampagne durchgeführt. Das Ziel der Kampagne war es, die Aktivität der Phytase in den neutralen pH-Bereich auszuweiten. Dazu wurden Phytase-Bibliotheken mittels epPCR und darauf folgender Sättigungsmutagenese (der bei Durchmusterung der epPCR-Phytase Bibliothek identifizierten vorteilhaften Positionen) erstellt. Die Varianten YmPh-M10 und -M16 wurden isoliert und zeigten eine 7-fach verbesserte spezifische Aktivität bei pH 6,6 zum Modellsubstrat 4 Methylumbelliferylphosphat im Vergleich zum YmPhWT. Die zellfreie Durchflusszytometer-basierte Hochdurchsatzdurchmusterungsplattform reduziert drastisch den Zeitbedarf für eine Gelenkte Evolutionsrunde von mehreren Monaten auf nur einen Tag und ermöglicht die effiziente Durchmusterung von Mutantenbibliotheken (10^10) von hoher Diversität unter Abdeckung eines signifikanten Anteils der generierten Sequenzvielfalt auf zeiteffiziente Art und Weise. Aus diesem Grund bietet die zellfreie Durchflusszytometer-basierte Hochdurchsatzdurchmusterungsplattform eine ausgezeichnete Lösung um Herausforderungen in der Gelenkten Evolution zu bewältigen, z.B. die Durchführung von wiederholten Runden von Gelenkter Evolution und Durchmusterung von Mutantenbibliotheken von unbegrenzter Diversität, um erfolgreich vorteilhafte Varianten mit veränderter Selektivität, Spezifität oder Aktivität zu identifizieren. Zusätzlich besitzt die zellfreie Durchflusszytometer-basierte Hochdurchsatzdurchmusterungsplattform ausgezeichnetes Potential um anspruchsvolle, fundamentale Fragestellungen, wie die Erforschung von kombinatorischen Effekten oder Struktur-Funktions-Zusammenhängen in Biokatalysatoren zu beantworten. Zusätzlich bietet die zellfreie Durchflusszytometer-basierte Hochdurchsatzdurchmusterungsplattform die Möglichkeit an andere Enzymklassen angepasst zu werden, da eine allgemein anwendbare Fluoreszenz-basierte Sortierung der zellfrei exprimierten aktiven Enzymvarianten in (w/o/w) Emulsionskompartimenten verwendet wird.

Directed evolution is a powerful algorithm for tailoring industrially important biocatalysts. Methodological andconceptual advancements in directed evolution in the past decades enabled engineering of enzymes towardsunnatural substrates with catalytic efficiencies beyond natural enzymes. Despite all progress in the field ofdirected evolution the exploration of generated sequence space and acceleration of iterative rounds ofmutagenesis and screening is limited by throughput of commonly employed screening technologies.Development of ultrahigh throughput screening (uHTS) represents the main challenge in today’s state-of-theartdirected evolution and ideally, in contrast to medium screening formats, enables rapid analysis of up to 10^7events per hour using flow cytometry. The possibility to screen millions of variants within one day using uHTSoffers the opportunity to generate libraries of high mutational load to successfully identify and investigatestructure-function relationships or combinatorial effects within directed evolution campaigns. The latter is upto now unobtainable employing standard screening formats due to cost and time limitations of directedevolution campaigns. Most of reported uHTS screening systems employ in vivo screening where the bacterialhost is used as carrier of enzyme variants. The main limitation of the cell-based systems is the lowtransformation efficiency resulting in reduced gene diversity. In this study we developed an uHTS platform inwhich cells were replaced by cell-free transcription-translation machinery encapsulated within artificial cell-likecompartments (water-in-oil-in-water (w/o/w) emulsions). Each emulsion compartment encapsulates a singlegene copy of a highly diverse gene library (10^8). Upon cell-free transcription and translation of genes, encodingactive enzyme variants, compartments are labelled by conversion of fluorogenic substrate into fluorescentproduct and are analyzed by flow cytometry. In vitro compartmentalization (IVC) enables genotype-phenotypelinkage and isolation of genes encoding for active enzyme variants from an excess of genes encoding inactiveenzymes. The uHTS screening platform was developed for cellulase (CelA2) using in vitro production of CelA2enzyme within (w/o/w) emulsions and fluorescein-di-beta-D-cellobioside (FDC)-fluorescein substrate-product pair(Ex.: 494 nm/Em.: 516 nm). The developed uHTS cell-free compartmentalization platform was validated byscreening of a random epPCR cellulase mutagenesis library and yielded an improved cellulase variant withinonly two weeks. The identified variant CelA2-H288F-M1 (N273D/N468S) showed 5-fold reduced KM value and13.3-fold increased specific activity (220.60 U/mg) compared to cellulase wild type (16.57 U/mg). The uHTS invitro based platform was employed to study differences between three focused mutagenesis approaches(iterative site-saturation mutagenesis, multiple site-saturation mutagenesis, and simultaneous saturationmutagenesis of four amino acid positions i.e. OmniChange) in order to explore combinatorial effects. As anoutcome the best performing variant contained only two amino acid substitutions (F288 and Q524) andshowed 8-fold improvement in specific activity compared to parent.In order to expand the uHTS platform on other enzymes, in this study in vitro based screening assay for Yersiniamollaretii phytase wildtype (YmPhWT) was optimized. Due to discrepancies between pH optimum for cell-freeexpression machinery (pH 7) and acidic pH optimum of YmPhWT, optimization of YmPhWT through a directedevolution campaign was performed. The goal of the campaign was to broaden the activity of the phytasetowards neutral pH. Phytase libraries were generated via epPCR and subsequent simultaneous site-saturationmutagenesis based on identified beneficial positions in the epPCR library screening. The variants YmPh-M10and -M16, showing 7-fold improved specific activity at pH 6.6 towards the model substrate4-methylumbelliferylphosphate (4-MUP) compared to YmPhWT, were isolated.The flow cytometer-based uHTS-IVC technology platform drastically reduces time requirements for one roundof directed evolution from several months to only one day and enables an efficient screening of mutantlibraries (10^10) with high diversity covering a significant portion of the generated sequence space in a timeefficient manner. Consequently, the flow cytometer-based uHTS-IVC technology platform offers an efficientsolution to tackle present challenges of directed evolution, like the performance of multiple, iterative rounds ofdiversity generation and screening of mutant libraries with unlimited diversity, in order to successfully identifybeneficial variants with altered selectivity, specificity or activity. In addition, the flow cytometer-based uHTSIVCtechnology platform has an impressive potential to study demanding/challenging scientific questions e.g.the exploration of combinatorial effects and answering fundamental questions on structure-functionrelationships within biocatalysts. Additionally, the uHTS technology platform can - from our point of view - beadapted to other enzyme classes since it uses a widely applicable fluorescence sorting of cell-free expressedactive enzyme variants within (w/o/w) emulsions compartments.

OpenAccess:
PDF PDF (PDFA)
(additional files)