Analyse von Effektorproteinen in Interaktionen von Pilzen der Gattung Pyricularia (Magnaporthe) mit Gerste

Mogga, Valerie; Panstruga, Ralph; Deising, Holger; Schaffrath, Ulrich

doi:10.18154/RWTH-2017-00816

Analyse von Effektorproteinen in Interaktionen von Pilzen der Gattung Pyricularia (Magnaporthe) mit Gerste = Analysis of effector proteins in interactions of fungi of the genus Pyricularia (Magnaporthe) with barley

Mogga, Valerie

2016 & 2017

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Dipl.-Biol. Valerie Laura Mogga

ImpressumAachen 2016

Umfang1 Online-Ressource (132 Seiten) : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, RWTH Aachen University, 2016

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University 2017

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Schaffrath, Ulrich (Thesis advisor)^RWTH* ; Deising, Holger (Thesis advisor) ; Panstruga, Ralph (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2016-10-17

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2017-00816
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/682325/files/682325.pdf
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/682325/files/682325.pdf?subformat=pdfa

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Magnaporthe oryzae (frei) ; Gerste (frei) ; Effektor (frei) ; Nekrose (frei) ; NUDIX Hydrolase (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Phytopathogene Pilze der Gattung Pyricularia sind mit Pflanzen aus der Familie der Süßgräser assoziiert. Während einige der weltweit bedeutendsten Nahrungsmittelpflanzen, wie Reis, Weizen oder Gerste von Isolaten der Art P. oryzae (morph Magnaporthe oryzae) infiziert werden können, sind dieselben Pflanzen vor Infektionen von Isolaten der Arten P. grisea (morph Magnaporthe grisea) oder P. penniseticola durch Nichtwirtresistenz geschützt. Nichtwirtresistenz ist definiert als die Resistenz einer Pflanzenart gegenüber allen Pathotypen einer Pathogenart. Um Pflanzen erfolgreich infizieren zu können, sekretieren Phytopathogene so genannte Effektoren um die Immunabwehr des Wirtes zu umgehen oder zu manipulieren. Das Repertoire an Effektormolekülen eines Pathogens dient demzufolge als eine Art Schlüssel, der Zugang zu Wirtpflanzen vermittelt. Um das spezifische Effektorrepertoire verschiedener Arten der Gattung Pyricularia zu untersuchen, wurde in einer Microarray-Analyse das Transkriptom des M. oryzae Isolats TH6772 mit dem des P. penniseticola Isolats CD180 während Wirt- bzw. Nichtwirtinteraktion mit Gerste (Hordeum vulgare) vergleichend analysiert. Auf diese Weise konnten Effektorkandidatengene identifiziert werden, die differenziell in der Wirtinteraktion exprimiert werden und für kleine, sekretierte Proteine kodieren, so genannte MoHEGs (M. oryzae Hypothetical Effector Genes). Durch Transkriptabundanzanalysen während des gesamten Interaktionsverlaufes (0-96 h p.i.) zwischen M. oryzae und Gerste wurde deutlich, dass MoHEGs ausschließlich während der biotrophen Phase des Lebenszyklus des Pathogens exprimiert werden. Innerhalb dieser können sie in zwei verschiedene Gruppen eingeteilt werden, je nachdem, ob sie ein Expressionsmaximum vor und während der Penetration (Frühe MoHEGs) oder während der Kolonisierung der Wirtpflanze (Späte MoHEGs) aufwiesen. Transkripte Früher MoHEGs können, im Gegensatz zu Späten MoHEGs, auch in in vitro gekeimten Konidien detektiert werden, d.h. Frühe MoHEGs sind auch unabhängig von der Pflanzeninteraktion induziert. Funktionale Analyse zeigte, dass dem Frühen MoHEG16 eine wichtige Rolle während der Wirtinteraktion zukommt. Mikroskopische Analyse dreier unabhängiger Δmoheg16 Mutanten zeigte signifikant weniger kollabiertes Mesophyllgewebe in Gerste nach 72 h p.i. im Vergleich zum korrespondierenden Wildtyp. MoHEG16 stellt folglich einen Virulenzeffektor dar, durch dessen Verlust die Virulenz des Pathogens deutlich abgeschwächt wird. Desweiteren wurde untersucht, ob Späte MoHEGs den M. oryzae-Nep1 (Necrosis- and Ethylene-inducing Protein1)-Like Protein (MoNLP) vermittelten Zelltod in N. benthamiana unterdrücken können. Dabei stellte sich heraus, dass MoHEG13 eine solche Zelltod supprimierende Eigenschaft besitzt und somit möglicherweise MoNLP vermittelte Funktionen, die in der M. oryzae - Gerste Interaktion von Bedeutung sind, beeinflussen kann oder tatsächlich an einer generellen Koordination von Zelltodmechanismen beteiligt sein könnte. Weiterhin wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit die Wirt- bzw. Nichtwirtinteraktion zwischen D. sanguinalis und M. grisea bzw. M. oryzae cytologisch charakterisiert. Es wurden putative Orthologe zu den MoHEGs in M. grisea identifiziert (MgHEGs) und deren Expression während einer kompatiblen Interaktion untersucht. Es stellte sich heraus, dass in fast allen Fällen orthologe Effektorkandidaten beider Arten ähnlich reguliert sind, d.h. es kann spekuliert werden, dass deren Expression einem innerhalb der Gattung Pyricularia konservierten Infektionsmechanismus zu Grunde liegt. Neben den MoHEGs wurde auch die Rolle von MoNUDIX als potenzieller Pathogenitätsfaktor oder Effektor in M. oryzae während Interaktion mit Gerste untersucht. Bei der funktionalen Analyse von MoNUDIX durch Überexpression und „Silencing“ stellte sich durch quantitative mikroskopische Analyse heraus, dass eine Überexpression des Gens den Infektionsverlauf im Vergleich zum korrespondierenden Wildtyp beschleunigt bzw. konnten Hinweise erhalten werden, dass die Reduktion der Transkriptmenge des Gens das pathogene Wachstum beeinträchtigt. MoNUDIX kann somit, wie MoHEG16, als Virulenzeffektor bezeichnet werden.

Phytopathogenic fungi of the genus Pyricularia are associated with the plant family Poaceae. While major crop plants like rice, barley or wheat can be infected by P. oryzae (morph Magnaporthe oryzae), these plants are protected against isolates of the species P. grisea (morph Magnaporthe grisea) or P. penniseticola by nonhost resistance. Nonhost resistance is defined as the capacity of an entire plant species to resist infection by all isolates of a given microbe species. To successfully infect host plants, phytopathogens secrete effector molecules to circumvent or manipulate the plant immune system. The repertoire of effectors therefore contributes to host range of a pathogen. To analyze differences in effector repertoires of host and nonhost isolates from barley, transcriptomes of the M. oryzae isolate TH6772 and of the P. penniseticola isolate CD180 were compared during their interaction with barley by microarray analysis. Based on this approach, transcripts encoding small secreted effector proteins were identified that accumulate to a significantly higher extent during host interaction of barley with M. oryzae [designated M. oryzae Hypothetical Effector Genes (MoHEGs)] than during nonhost interaction with P. penniseticola. Analyses of transcript abundances during host interaction between M. oryzae and barley (0-96 h p.i.) showed that MoHEGs are differentially expressed during biotrophic interaction. Furthermore they can be differentiated into two groups according to their maximum transcript abundances (prior to or during penetration: EarlyMoHEGs or during colonization: LateMoHEGs). In contrast to LateMoHEGs, early-induced MoHEGs with expression maximum at 0 and 6 h p.i. were also transcribed during plant-independent in vitro germination of conidia. Functional analysis disclosed a crucial function for EarlyMoHEG16 during barley infection as mesophyll cell collapse was significantly reduced in barley host plants infected with three independent Δmoheg16 mutants compared to barley inoculated with the corresponding M. oryzae wild type isolate. Hence, although MoHEG16 mutation does not cause complete loss of M. oryzae virulence on barley, MoHEG16 constitutes a M. oryzae virulence factor. Additionally, LateMoHEG13 was found to suppress M. oryzae-Nep1 (Necrosis- and Ethylene-inducing Protein1)-Like Protein (MoNLP)-derived cell death in N. benthamiana. For that reason MoHEG13 may play a role in coordination of cell death induction by the fungus in general or possibly regulate other NLP-mediated responses during M. oryzae infection processes. Furthermore, putative orthologs to MoHEGs were identified in M. grisea isolate BR29 (MgHEGs) that showed a similar, MoHEG-like expression pattern during a compatible interaction. Although direct evidence has yet to be provided, these data indicate that HEG effectors might be similarly deployed by both species for successful host infection, thereby being part of an evolutionary conserved fungal infection strategy. Apart from MoHEGs another putative pathogenicity factor of M. oryzae was analyzed for its function in the M. oryzae - barley interaction. The NUDIX hydrolase MoNUDIX was functionally characterized by over-expression and silencing of the corresponding gene(s). Quantitative microscopic analysis of the mutants revealed that over-expression accelerates infection process whereas down-regulation of the gene seems to restrict pathogenic growth. MoNUDIX therefore represents a so far unknown pathogenicity factor in M. oryzae.

OpenAccess:
PDF PDF (PDFA)
(additional files)