Synthesis of oxo-fatty acid esters in a whole cell cascade reaction with engineered monooxygenase (P450 BM3) and dehydrogenase (cpADH5) variants

Ensari, Yunus; Schwaneberg, Ulrich; Oldiges, Marco

doi:HT019601268

Synthesis of oxo-fatty acid esters in a whole cell cascade reaction with engineered monooxygenase (P450 BM3) and dehydrogenase (cpADH5) variants

Ensari, Yunus^RWTH*

2018

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Master of Science (Biotechnology) Yunus Ensari

ImpressumAachen 2018

Umfang1 Online-Ressource (viii, 161 Seiten) : Illustrationen

Dissertation, RWTH Aachen University, 2018

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Schwaneberg, Ulrich (Thesis advisor)^RWTH* ; Oldiges, Marco (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2018-02-19

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2018-221289
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/717273/files/717273.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
alcohol dehydrogenase (frei) ; directed evolution (frei) ; monooxygenase (frei) ; protein engineering (frei) ; whole cell catalysis (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Hydroxyl- oder Keton-funktionalisierte Fettsäuremethylester sind wichtige Verbindungen im Rahmen der Produktion von Pharmazeutika, Kosmetika und Nahrungsergänzungsmittel. Beispielsweise wird 3-Hydroxyhexanoate oder das entsprechende Methylester in der Synthese von Laulimalide verwendet, welches ein Antikrebs Wirkstoff darstellt. Die Biokatalyse hat durch enzymatische Kaskaden die Aufmerksamkeit für die Entwicklung von effizienteren, nachhaltigeren und „grüneren“ Syntheseprozessen zur Produktion komplexer wertvoller chemischen Verbindungen gewonnen. Des Weiteren bieten Ganzzellkatalysatoren, die Enzymkaskaden nutzen, wichtige Vorteile gegenüber klassischen chemischen Katalysatoren sowie enzymbasierten Biotransformationen, wie z.B. Kofaktorregeneration durch den Zellmetabolismus, Verzicht auf Proteinaufreinigungsschritte und Erhöhung der Enzymstabilität. In der vorliegenden Thesis, wurde ein Ganzzellkatalysator entwickelt, welches aus einer gekoppelten Kaskadenreaktion von einer P450 BM3 und cpADH5 besteht. Diese dienen zur Synthese von Hydroxy- oder Ketofettsäuremethylester, welches eine „grünere“ Produktionsroute darstellt. Die P450 BM3 Monooxygenase aus Bacillus subtilis und die Alkoholdehydrogenase aus Candida parapsilosis (cpADH5) sind leistungsstarke Enzyme und wurden zur Synthese zahlreicher industriell relevanter Verbindungen genutzt. Jedoch werden Fettsäuremethylester sowie Hydroxyfettsäuremethylester jeweils von beiden Enzymen nur sehr schwach als Substrat akzeptiert. P450 BM3 und cpADH5 wurden evolviert, um die Umsetzung von Methylhexanoat durch P450 BM3 und Methyl-3-hydroxyhexanoat durch cpADH5 zu ermöglichen. In Kapitel I wurde die Gelenkte Evolution von P450 BM3 unter Verwendung des KnowVolution Ansatz durchgeführt. Die Variante P450 BM3 YE_M1_2 wies eine verstärkte Aktivität gegenüber Methylhexanoat auf. Die initialen Oxidationsrate von YE_M1_2 gegenüber Methylhexanoat 32-fach höher im Vergleich zum WT Enzym. Darüber hinaus wurde eine 1,5-fach erhöhte Methyl-3-hydroxyhexanoat Produktion erreicht (YE_M1_2; 2,75 mM and WT; 1,8 mM). Hinzukommend zeigte eine zweite verbesserte Variante, YE_M3_1, eine 5,4-fach erhöhte initiale Oxidationsrate (YE_M3_1; 1085 min-1 and WT; 146 min-1) im Vergleich zum WT und 1,6-fach erhöhte Gesamtproduktbildung im Vergleich zur parentalen Variante P450 BM3 F87A/A328I (YE_M3_1; 1,3 mM and F87A/A328I; 0,8 mM). Das Enzym cpADH5 wurde mittels eines rechnergestützten Ansatzes für die Umsetzung von Methyl-3-hydroxyhexanoat zum entsprechenden Keton evolviert. Molekulare Dockingstudien zeigten, dass W286 in der kleinen Bindungstasche lokalisiert ist und den Zugang zu Substraten mit aliphatischen Ketten, die länger als Ethylsubstituenten sind, limitiert. Desweiteren, wurde zusätzlich zu W286 auch die Aminosäureposition L119 mittels Sättigungsmutagenese mutiert. Experimentell konnte gezeigt werden, dass L119 und W286 eine Schlüsselrolle in der Umsetzung von methyl 3-hydroxy Fettsäuren mittlerer kettenlänge hat. Eine kinetische Charakterisierung von W286A zeigte eine 5,5-fache Erhöhung von Vmax und 9,6-fache niedrigeren Km Wert gegenüber Methyl-3-hydroxyhexanoat (Vmax: 2,48 U/mg und Km: 4,76 mM). Eine simultane Sättigungsmutagenese an den Positionen 119 und 286 ergab eine Doppelmutante (L119M/W286S) mit einer mehr als 30-fach erhöhten Aktivität gegenüber Methyl-3-hydroxyhexanoat (WT: keine Umsetzung; L119M/W286S: 30 %). Interessanterweise zeigte die Variante L119M/W286S eine invertierte Enantiopräferenz (S-Enantiomer ≥ 99% Aktivitätsabnahme und R-Enantiomer > 20-fache Aktivitätserhöhung) gegenüber Methyl-3-hydroxybutyrat. Des Weiteren wurden die beiden Mutagenesemethoden, die Iterative Sättigungsmutagenese (ISM) und OmniChange Technologie miteinander verglichen. Das Enzym cpADH5 wurde über multiple Sättigungsmutagenese zur Oxidation von Methyl-3-hydroxyhexanoat zum korrespondierenden Keton optimiert. Die Aminosäupositionen C57, W116, L119 und W286, welche sich in der Substratbindetasche des cpADH5 befinden, wurden basierend auf rechnergestützte Analysen sowie durch Literaturrecherchen ausgewählt. Die ausgewählten Positionen wurden mittels ISM sowie OmniChange mutiert. Darüber hinaus wurden sowohl die Methoden als auch die erhaltenen Akivititätsverbesserungen miteinander verglichen. Die beste Variante (C57V/W286S) wurde mittels OmniChange identifiziert und zeigte eine 108-fach verbesserte Aktivität, während die über ISM erhaltene beste Variante eine 82-fach verbesserte Oxidation von Methyl-3-hydroxyhexanoat im Vergleich zu cpADH5 WT aufwies. Außerdem unterstützte eine molekulare Dockinganalyse die Überlegenheit der OmniChange Variante. Die Variante cpADH5 C57V/W286S zeigte eine um 0,77 kcal/mol niedrigere Bindungsenergie (W286A: -4,74 kcal/mol und C57V/W286S: -5,51 kcal/mol) und katalytisch wichtige Distanzen. Zum Abschluss wurde der Ganzzellkatalysator für die Synthese von Methyl-3-hydroxyhexanoat oder Methyl-3-oxohexanoat durch Kombination der verbesserten P450 BM3 und cpADH5 Variante in einem künstlichen Operon erstellt. Unter den optimierten Prozessbedingungen konnte der Ganzzellkatalysator bis zu 2 mM Gesamtprodukt nach 48 h generieren. Eine Biotransformation mit Rohzelllysat ergab 3.8 mM Gesamtprodukt nach 48 h mit einer Umsatzrate von nahezu 40 %. Ein Ganzzellkatalysator für die Synthese von Methyl-3-hydroxyhexanoat oder Methyl-3-oxohexanoat wurde durch co-expression von P450 BM3 und cpADH5 evolvierten Varianten erfolgreich etabliert.

Hydroxyl or ketone functionalized fatty acid methyl esters are important compounds for production of pharmaceuticals, cosmetics or dietary supplements. For instance, 3-hydroxyhexanoate or its methyl ester is used in the synthesis of laulimalide which is an anticancer drug. Biocatalysis through enzymatic cascades has drawn attention for the development of more efficient, sustainable, and greener synthetic processes to produce complex valuable chemical compounds. Furthermore, whole cell catalysts which employs enzyme cascade offers important advantageous over classical chemical catalysis and enzyme based biotransformation such as; cofactor regeneration by the cell metabolism, omission of protein purification steps and increased enzymes. In this thesis, a whole cell catalyst which includes a P450 BM3 and cpADH5 coupled cascade reaction was developed for the synthesis of hydroxy- or keto- fatty acid methyl esters, which is a greener route for production. P450 BM3 monooxygenase from Bacillus subtilis and alcohol dehydrogenase from Candida parapsilosis (cpADH5) are powerful enzymes and have been used for the synthesis of many industrially relevant compounds. However, P450 BM3 and cpADH5 poorly accept fatty acid methyl esters and hydroxy-fatty acid methyl esters as substrate respectively. P450 BM3 and cpADH5 enzymes were engineered in order to enable the conversion of methyl hexanoate by P450 BM3 and methyl 3-hydroxyhexanoate by cpADH5. In chapter I, the directed evolution of P450 BM3 was performed by employing the KnowVolution approach. The P450 BM3 YE_M1_2 variant exhibited boosted performance toward methyl hexanoate. Initial oxidation rate of YE_M1_2 toward methyl hexanoate was determined to be 32 fold higher when compared to WT enzyme. Furthermore, 1.5 fold increased methyl 3-hydroxyhexanoate production was obtained with YE_M1_2 variant (YE_M1_2; 2.75 mM and WT; 1.8 mM). In addition, a second improved P450 BM3 variant named as YE_M3_1 showed 5.4 fold improved initial oxidation rate (YE_M3_1; 1085 min-1 and WT; 146 min-1) in comparison to WT and 1.6 fold increased total product formation when compared to P450 BM3 F87A/A328I parental variant (YE_M3_1; 1.3 mM and F87A/A328I; 0.8 mM). cpADH5 enzyme was engineered through computational assisted approach for conversion of methyl 3-hydroxyhexanoate into corresponding ketone. Molecular docking studies revealed that W286 is located in the small binding pocket and limits the access to substrates that contain aliphatic chains longer than ethyl substituent. In addition to W286, L119 residue was mutated as well through site saturation mutagenesis. Experimental findings showed that, L119 and W286 are key residues to boost oxidation of medium chain methyl 3-hydroxy fatty acids. Kinetic characterization of W286A showed a 5.5 fold increase of Vmax and a 9.6 fold decrease of Km values toward methyl 3-hydroxyhexanoate (Vmax: 2.48 U/mg and Km: 4.76 mM). Simultaneous saturation at positions 119 and 286 yielded a double mutant (L119M/W286S) with more than 30 fold improved activity toward methyl 3-hydroxyoctanoate (WT: no conversion; L119M/W286S: 30 %). Interestingly, L119M/W286S variant exhibited inverted enantiopreference (S-enantiomer ≥ 99% activity decrease and R-enantiomer > 20 fold activity improvement) toward methyl 3-hydroxybutyrate. Additionally, a comparison of the mutagenesis methods Iterative Saturation Mutagenesis (ISM) and OmniChange was performed. cpADH5 enzyme was engineered through multiple site saturation mutagenesis for oxidation of methyl 3-hydroxyhexanoate into corresponding ketone. The residues; C57, W116, L119, and W286 which lie in substrate binding pocket of cpADH5 were selected through computational analysis and from literature. Selected positions were mutated through ISM and OmniChange. Furthermore the employed methods as well as the obtained activity improvements were compared. The best variant (C57V/W286S) obtained from OmniChange showed 108 fold improved activity while the best variant (W286A) from ISM showed 82 fold improved methyl 3-hydroxyhexanoate oxidation in comparison to cpADH5 WT. Moreover, molecular docking analysis also supported the superiority of OmniChange variant. The cpADH5 C57V/W286S variant had 0.77 kcal/mol less binding energy (W286A: -4.74 kcal/mol and C57V/W286S: -5.51 kcal/mol) and decrease in catalytically important distances. Finally, the whole cell catalyst for synthesis of methyl 3-hydroxyhexanoate or methyl 3-oxohexanoate was constructed by combining the engineered P450 BM3 and cpADH5 variants in an artificial operon. Under the optimized process conditions, the whole cell catalyst produced up to 2 mM total product after 48 h., Biotransformation with crude cell lysate yielded 3.8 mM total product after 48 h with almost 40% conversion rate. A whole cell catalyst for the synthesis of methyl 3-hydroxyhexanoate or methyl 3-oxohexanoate was successfully established by co-expressing P450 BM3 and cpADH5 engineered variants.

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