Tandem-mass-spectrometry-driven investigation of the anaplerotic reactions in Corynebacterium glutamicum

Kappelmann, Jannick; Wiechert, Wolfgang; Takors, Ralf

doi:37675

Tandem-mass-spectrometry-driven investigation of the anaplerotic reactions in Corynebacterium glutamicum = Tandem Massenspektrometrie getriebene Untersuchung der anaplerotischen Reaktionen in Corynebacterium glutamicum

Kappelmann, Jannick^RWTH*

2018

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Jannick Kappelmann

ImpressumAachen 2018

Umfang1 Online-Ressource (xix, 213 Seiten) : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen, 2018

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak04

Hauptberichter/Gutachter
Wiechert, Wolfgang (Thesis advisor)^RWTH* ; Takors, Ralf (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2018-02-23

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2018-231115
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/751130/files/751130.pdf

Einrichtungen

Lehrstuhl für Computational Systems Biotechnology (FZ Jülich) (420410)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
13C-Metabolic Flux Analysis (frei) ; Anaplerosis (frei) ; tandem mass spectrometry (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 620

Kurzfassung
Die anaplerotischen Reaktionen bilden ein zyklisches Reaktionsnetzwerk um die Metabolite Phosphoenolpyruvat, Pyruvat, Oxaloacetat und Malat, dessen Carboxylierungs- und Decarboxylierungsreaktionen eine Verbindung zwischen Glykolyse und Tricarbonsäure (TCA)-Zyklus herstellen. Die Netto-Aktivität der anaplerotischen Carboxylierung ist essentiell zur Bereitstellung von TCA- Zyklus Intermediaten und ist daher limitierend für die Biosynthese von aus letzteren abgeleiteten Aminosäuren, insbesondere L-Lysin und L-Glutamat. Der Großteil der Weltproduktion dieser beiden Aminosäuren wird durch die biotechnologische Nutzung von Corynebacterium glutamicum bestritten, einem Arbeitspferd der Biotechnologie und Modellorganismus der Systembiologie gleichermaßen. Die herausragende Bedeutung der anaplerotischen Reaktionen für die biotechnologische Nutzung von C. glutamicum motiviert diese Arbeit. Einleitend klärt eine theoretische Untersuchung die Ursache für erfolglos bestimmte anaplerotische Aktivitäten mittels 13C-Metabolischer Stoffflussanalyse (13C-MFA) in vorherigen Studien auf. Unter Nutzung einer fokussierten Isotopomer-Bilanz des anaplerotischen Reaktionsnetzwerkes kann ohne Beschränkung der Allgemeinheit gezeigt werden, dass für C. glutamicum lediglich Deletionsmutanten in anaplerotischen Reaktionen eine eindeutige Bestimmung der anaplerotischen Flüsse aus stationären isotopischen 13C-Markierungsdaten zulassen. Dieser Befund erzwang die Untersuchung einer Sammlung von Einzel- und Doppeldeletionsmutanten, deren Metabolismus mittels Triple Quadrupol-Masspenspektrometrie (QqQ MS) untersucht wurde. Mittels Quadrupole-Flugzeit-Massenspektrometrie (QqTOF MS) wurde ein Proteom-Datensatz erzeugt, aus dem unter Nutzung eines Regressionsansatzes präzise relative Änderungen für ein knappes Drittel der Proteine von C. glutamicum geschätzt wurden. Eine wesentliche biologische Erkenntnis aus der Gesamtheit der Daten besteht in dem rigorosen Nachweis, dass der Glyoxylat-Zyklus als anaplerotische Reaktion unter ausschließlich glykolytischen Bedingungen in C. glutamicum aktiv sein kann, was durch eine Metabolit-Protein Interaktion und keine Mutation der relevanten Regulatoren vermittelt wird. Der Befund einer inkonsistenten Flussschätzung im Rahmen einer 13C-MFA der untersuchten Stämme veranlasste die Entwicklung einer neuen QqTOF MS-basierten Akquisitionsmethode, die die Kollisions-induzierte Dissoziation (CID) von Anionen des Zentralstoffwechsels und Kationen von Aminosäuren zur positionsaufgelösten 13C-Markierungsmessung nutzt. Zu diesem Zweck wurden akkurate Massenspektrometrie, selektiv-markierte Standards und publizierte Fragmentierungswege genutzt, um alle dominanten Massenpeaks einer großen Auswahl von Metaboliten strukturell zu annotieren. Die vorgenommene Analyse stellt die detaillierteste Beschreibung des Verbleibs von Kohlenstoffatomen in LC-ESI-MS/MS Fragmenten dar. Über die Positionsauflösung hinaus, kann gezeigt werden, dass die CID von Aminosäuren dazu genutzt werden kann, 13C- und 15N-Massenisotopomere dieser Metabolitklasse analytisch zu trennen, ohne sie in der m/z-Domäne aufzulösen.

The anaplerotic reactions form the basis of a circular reaction network around the metabolites phosphoenolpyruvate, pyruvate, oxaloacetate, and malate, comprising specific carboxylation and decarboxylation reactions which link glycolysis to the tricarboxylic acid cycle. The net carboxylation activity of anaplerotic reactions is essential for the replenishment of tricarboxylic acid cycle intermediates and therefore directly limits the biosynthetic flux towards amino acids derived from it, most notable L-lysine and L-glutamate. The microbial production of these amino acids is primarily accounted for by the biotechnological usage of Corynebacterium glutamicum, a major workhorse of industrial biotechnology and model organism of systems biology alike. The pivotal role of anaplerotic reactions in the biotechnological usage of C. glutamicum motivates the present thesis which is dedicated to a thorough study of these reactions in this organism. First, a theoretical analysis establishes the reason for the unsuccessfully determined anaplerotic reaction activities by 13C-Metabolic Flux Analysis (13C-MFA) in previous studies. Using a focused isotopomer network of the anaplerotic node, it is shown in full generality that for C. glutamicum only certain anaplerotic deletion mutants allow to uniquely determine the anaplerotic fluxes from stationary 13C-isotopomer data. This result prompted the investigation of a set of single and double deletion mutants whose metabolome was investigated by a protocol employing a liquid chromatography electrospray ionization triple quadrupole mass spectrometry (LC-ESI-QqQ MS) platform. By means of quadrupole-time-of-flight technology (QqTOF) a proteome data set for the investigated deletion mutants was generated and evaluated with a novel regression approach, yielding precise fold changes for almost a third of all open reading frames of C. glutamicum. A major biological finding arising from the total data set consists in the proof that the glyoxylate shunt can be active as anaplerotic reaction in C. glutamicum under solely glycolytic conditions, which is brought about by a metabolite-regulator interaction. The finding of inconsistently estimated fluxes in a 13C-Metabolic Flux Analysis of the investigated strains prompted the development of a novel LC-ESI-QqTOF MS-based 13C-profiling method, which harvests the collision induced dissociation (CID) of product anions of central metabolism as well as product cations of amino acids for the positional resolution of 13C-label enrichment. For this purpose, accurate mass spectrometry, selectively-labeled standards, and published fragmentation pathways are used to structurally annotate all dominant mass peaks of a large collection of metabolites, resulting in the most detailed map of the carbon atom fate of LC-ESI-MS/MS collisional fragments yet. Apart from providing positional resolution of 13C-enrichment, it is shown that the CID of amino acids can be harvested to separate 13C- and 15N-isotopic species of these metabolites without resolution in the m/z domain.

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