h1

000752832 001__ 752832
000752832 005__ 20230408005822.0
000752832 0247_ $$2HBZ$$aHT019934997
000752832 0247_ $$2Laufende Nummer$$a37833
000752832 0247_ $$2datacite_doi$$a10.18154/RWTH-2019-00264
000752832 037__ $$aRWTH-2019-00264
000752832 041__ $$aEnglish
000752832 082__ $$a540
000752832 1001_ $$0P:(DE-588)1175595349$$aGiesbertz, Anna$$b0$$urwth
000752832 245__ $$aTriple helix-targeted DNA methylation with DNA methyltransferase-oligodeoxynucleotide conjugates$$cvorgelegt von Anna Giesbertz (M.Sc.)$$honline
000752832 246_3 $$aTripelhelix-gesteuerte DNA Methylierung mit DNA Methyltransferase-Oligodesoxynukleotidkonjugate$$yGerman
000752832 260__ $$aAachen$$c2018
000752832 260__ $$c2019
000752832 300__ $$a1 Online-Ressource (VII, 104 Seiten) : Illustrationen, Diagramme
000752832 3367_ $$02$$2EndNote$$aThesis
000752832 3367_ $$0PUB:(DE-HGF)11$$2PUB:(DE-HGF)$$aDissertation / PhD Thesis$$bphd$$mphd
000752832 3367_ $$2BibTeX$$aPHDTHESIS
000752832 3367_ $$2DRIVER$$adoctoralThesis
000752832 3367_ $$2DataCite$$aOutput Types/Dissertation
000752832 3367_ $$2ORCID$$aDISSERTATION
000752832 500__ $$aVeröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University 2019
000752832 502__ $$aDissertation, RWTH Aachen University, 2018$$bDissertation$$cRWTH Aachen University$$d2018$$gFak01$$o2018-11-09
000752832 5203_ $$aIn dieser Arbeit wurden drei verschiedene prokaryotische DNA Methyltransferasen (MTasen) mit der CpG-Erkennungssequenz jeweils mit einem Tripelhelix-bildenden Oligodesoxynukleotid (TFO) gekuppelt. Die hergestellten Konstrukte dienten zur spezifischen Methylierung eines CpGs innerhalb der Promoterregion des epithelialen Zelladhäsionsmoleküls (EpCAM). Die Überexprimierung von EpCAM wurde in vielen Karzinomen gefunden und korreliert mit dem Methylierungsstatus in der Promoterregion (van der Gun et al., 2008). SNAP-tag Fusionsproteine von M.SssI, M.MpeI und M.MpeI(Q142L) wurden mittels SNAP-tag Technologie mit dem Benzyl-Kohlenstoff eines parasubstituierten Benzylguanins (BG) verbunden. Dazu erfolgte zunächst die BG-Modifikation des TFOs in zwei Schritten, bei denen BG-PEG35-TFO mit einer Gesamtausbeute von 65% erhalten wurde. Bei der Aufreinigung von M.SssI-TFO konnte das restliche BG-PEG35-TFO nicht von dem Produkt abgetrennt werden und M.SssI-TFO wurde daher nicht weiter untersucht. Die Konjugate M.MpeI-TFO und M.MpeI(Q142L)-TFO wurden mit einer Ausbeute von 55% beziehungsweise 16% erhalten. Die Spezifität von M.MpeI-TFO wurde in vitro in einem Modifikations-Restriktionsassay mit Litcon54 DNA getestet. Das Plasmid Litcon54 wurde dazu so entworfen, dass das TFO in der Nähe des addressierten CpGs bindet. Als Kontrolle diente Litcon47, ein vergleichbares Plasmid bei dem das TFO nicht die Möglichkeit hat an das Plasmid zu binden. Durch Inkubation mit der CpG Methylierungssensitiven Restriktionsendunuklease R.Psp1406I, wurde der Methylierungsstatus der geforderten CpGs überprüft. Die Spezifität wurde mit supercoiled, open-circular und linearem Plasmid getestet und bei allen drei Formen konnte spezifische Methylierung des addressierten CpGs festgestellt werden. Nichtspezifische Methylierung wurde auch beobachtet und stammte von entweder gebundenem oder ungebundenem M.MpeI-TFO. Nichtspezifische Methylierung durch gebundenes M.MpeI-TFO konnte im linearen Plasmid unterdrückt werden, was zu einer höheren spezifischen Methylierung des addressierten CpGs führte. Preinkubation von M.MpeI-TFO mit linearem Litcon54 hatte keinen Effekt auf die Spezifität. Höhere NaCl-Konzentrationen im Reaktionspuffer verringerten die DNA Bindungsaffinität von M.MpeI, aber vermutlich auch die Stabilität der Tripelhelix, sodass die Spezifität nicht erhöht wurde. Die höchste spezifische Methylierung des addressierten CpGs wurde mit 20 eq. M.MpeI(Q142L)-TFO und linearem Litcon54 erreicht. Zum einen führte die Verwendung des linearen Plasmids zur Unterdrückung nichtspezifischer Methylierung durch gebundenes Konjugat. Zum anderen führte die geringere DNA Bindungsaffinität der DNA MTase zu einer minimalen nichtspezifischen Methylierung durch ungebundenes Konjugat.$$lger
000752832 520__ $$aIn this work, three bacterial DNA methyltransferases (MTases), that methylate cytosine within the CpG recognition sequence, were coupled to a triple helix-forming oligodeoxynucleotide (TFO) to create constructs for targeted DNA methylation. The constructs were designed to target and methylate a single CpG site located in the promoter region of the epithelial cell adhesion molecule (EpCAM), of which the overexpression has been found in many carcinomas and is correlated to the methylation status within the promoter region (van der Gun et al., 2008). The coupling strategy was based on the SNAP-tag technology, with which the benzylic carbon of a para-substituted benzylguanine (BG) is connected to a variant of O6-alkylguanine DNA alkyltransferase (hAGT) that is fused with a DNA MTase. The BG modification of the TFO occurred in two steps and BG-PEG35-TFO was obtained with an overall yield of 65%. SNAP-tag fusion proteins of M.SssI, M.MpeI and the low DNA affinity mutant M.MpeI(Q142L) were then coupled to the BG-modified TFO. The purification of M.SssI-TFO by anion exchange chromatography proved to be challenging and the product that was obtained with a yield of less than 5% was contaminated with BG-PEG35-TFO, which could not be removed from the product. M.SssI-TFO was therefore not further investigated. The conjugates M.MpeI-TFO and M.MpeI(Q142L)-TFO could be purified by anion exchange chromatography with a yield of 55% and 16%, respectively. The DNA methylation specificity of M.MpeI-TFO was tested in vitro with a modification-restriction assay using Litcon54 DNA, a plasmid that was designed for the TFO to bind near a CpG site, and Litcon47, a similar plasmid lacking the triple helix-forming site (TFS). The methylation status of the challenged CpG sites was verified by incubation with the CpG methylation-sensitive restriction endonuclease R.Psp1406I. The experiment was carried out on supercoiled, open-circular, and linear plasmid. Specificity towards the target site was observed with all three forms of Litcon54. Non-specific methylation was also observed and derived from methylation by both unbound and bound M.MpeI-TFO. The latter could be suppressed in linear Litcon54, which led to a higher specificity towards the target site compared to the supercoiled and open-circular forms. Preincubation of M.MpeI-TFO with linear Litcon54 did not affect the specificity. Higher amounts of NaCl in the reaction buffer, that would decrease the affinity of M.MpeI-TFO with the DNA, possibly also reduced the stability of the triple helix and therefore did not increase the specificity towards the targeted site. The highest specificity towards the targeted site was achieved with 20 eq. of M.MpeI(Q142L)-TFO and linear Litcon54. Not only was non-specific methylation by bound conjugate suppressed due to the use of linear plasmid, but also the reduced DNA binding affinity of the DNA MTase led to minimal non-specific methylation by free M.MpeI(Q142L)-TFO.$$leng
000752832 588__ $$aDataset connected to Lobid/HBZ
000752832 591__ $$aGermany
000752832 653_7 $$aC5-DNA methyltransferases
000752832 653_7 $$aSNAP-tag technology
000752832 653_7 $$aprotein-DNA conjugates
000752832 653_7 $$atargeted DNA methylation
000752832 653_7 $$atriple helix formation
000752832 7001_ $$0P:(DE-82)005740$$aWeinhold, Elmar$$b1$$eThesis advisor$$urwth
000752832 7001_ $$aKiss, Antal$$b2$$eThesis advisor
000752832 8564_ $$uhttps://publications.rwth-aachen.de/record/752832/files/752832.pdf$$yOpenAccess
000752832 8564_ $$uhttps://publications.rwth-aachen.de/record/752832/files/752832_source.doc$$yRestricted
000752832 8564_ $$uhttps://publications.rwth-aachen.de/record/752832/files/752832_source.docx$$yRestricted
000752832 8564_ $$uhttps://publications.rwth-aachen.de/record/752832/files/752832_source.odt$$yRestricted
000752832 8564_ $$uhttps://publications.rwth-aachen.de/record/752832/files/752832.gif?subformat=icon$$xicon$$yOpenAccess
000752832 8564_ $$uhttps://publications.rwth-aachen.de/record/752832/files/752832.jpg?subformat=icon-1440$$xicon-1440$$yOpenAccess
000752832 8564_ $$uhttps://publications.rwth-aachen.de/record/752832/files/752832.jpg?subformat=icon-180$$xicon-180$$yOpenAccess
000752832 8564_ $$uhttps://publications.rwth-aachen.de/record/752832/files/752832.jpg?subformat=icon-640$$xicon-640$$yOpenAccess
000752832 8564_ $$uhttps://publications.rwth-aachen.de/record/752832/files/752832.jpg?subformat=icon-700$$xicon-700$$yOpenAccess
000752832 909CO $$ooai:publications.rwth-aachen.de:752832$$popenaire$$popen_access$$pVDB$$pdriver$$pdnbdelivery
000752832 9101_ $$0I:(DE-588b)36225-6$$6P:(DE-588)1175595349$$aRWTH Aachen$$b0$$kRWTH
000752832 9101_ $$0I:(DE-588b)36225-6$$6P:(DE-82)005740$$aRWTH Aachen$$b1$$kRWTH
000752832 9141_ $$y2018
000752832 915__ $$0StatID:(DE-HGF)0510$$2StatID$$aOpenAccess
000752832 9201_ $$0I:(DE-82)152920_20140620$$k152920$$lLehr- und Forschungsgebiet für Organische Chemie$$x0
000752832 9201_ $$0I:(DE-82)150000_20140620$$k150000$$lFachgruppe Chemie$$x1
000752832 961__ $$c2019-02-04T12:53:11.894767$$x2019-01-09T09:53:14.244597$$z2019-02-04T12:53:11.894767
000752832 9801_ $$aFullTexts
000752832 980__ $$aI:(DE-82)150000_20140620
000752832 980__ $$aI:(DE-82)152920_20140620
000752832 980__ $$aUNRESTRICTED
000752832 980__ $$aVDB
000752832 980__ $$aphd