Enzymatic functionalization and degradation of natural and synthetic polymers

Islam, Shohana Subrin; Schwaneberg, Ulrich; Elling, Lothar

doi:10.18154/RWTH-2019-02505

Enzymatic functionalization and degradation of natural and synthetic polymers = Enzymatische(r) Funktionalisierung und Abbau der natürlichen und synthetischen Polymeren

Islam, Shohana Subrin^RWTH*

2019

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Shohana Subrin Islam M.Sc. Biotechnologie

ImpressumAachen 2019

Umfang1 Online-Ressource (xii, 135 Seiten) : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, RWTH Aachen University, 2019

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Schwaneberg, Ulrich (Thesis advisor)^RWTH* ; Elling, Lothar (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2019-01-23

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2019-02505
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/756506/files/756506.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
protein engineering (frei) ; enzymes (frei) ; functionalization (frei) ; microplastic degradation (frei) ; polymers (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Enzyme sind effiziente Katalysatoren, um chemische Reaktionen unter milden Bedingungen (Umgebungstemperatur, Unterdruck) mit hoher Chemo-, Regio- und Enantioselektivität zu katalysieren. Enzymeigenschaften wie die spezifische Aktivität, Stabilität und Resistenz können mit Hilfe von Protein-Engineering verbessert werden. Ziel dieser Dissertation war das Engineering von zwei verschiedenen Enzymklassen (Transferase und Hydrolase) zur effizienten Funktionalisierung von Biopolymeren bzw. zur Depolymerisation von synthetischen Polymeren. Mit chemischen und enzymatischen Methoden können neue Funktionalitäten für Polysaccharide eingeführt werden. Glykosaminoglykane (GAG) gehören zu einer der wichtigsten Klassen funktioneller Polysaccharide in der Natur. Natürliche GAG werden hauptsächlich aus tierischen Quellen isoliert, was zu Massentierhaltung führen kann. Alternativ zu GAG können sulfatierte Polysaccharide (z. B. Cellulose) die Funktionalitäten von GAG, wie eine antikoagulative Wirkung und eine antivirale Aktivität, nachahmen. Dazu werden konventionelle chemische Methoden (direkte oder indirekte Sulfatierung) eingesetzt. Die enzymatische Sulfatierung durch Sulfotransferasen bietet im Gegensatz zur chemischen Sulfatierung eine grünere Möglichkeit, um Polysaccharid-Bausteine bei Raumtemperatur in wässriger Lösung mit einer hohen Regioselektivität zu sulfatieren. Hierbei stellen bakterielle Arylsulfotransferasen (AST) aufgrund ihres breiten Akzeptorspektrums und dem Einsatz kostengünstiger Sulfatdonatoren interessante Biokatalysatoren dar. Interessanterweise sind ASTs in der Lage, kleine Saccharide (z. B. Glukose) langsam zu sulfatieren. Eine Anpassung der ASTs durch Protein-Engineering-Methoden ist erforderlich, um die Aktivität dieser Enzyme für eine effiziente Sulfatierung von Sacchariden zu erhöhen. Die Arylsulfotransferase B (ASTB) von Desulfitobacterium hafniense wurde zu einem synthetisch attraktiven Sulfatierungs-Enzym für Saccharide weiterentwickelt. Dazu wurde ein gelenktes Evolutionsprotokoll für ASTB entwickelt und validiert. Ein bereits beschriebenes para-Nitrophenylsulfat (pNPS) Quantifizierungssystem wurde zu einem kontinuierlichen und robusten Durchmusterungssystem im 96-Well MTP-Format angepasst und optimiert (wahrer Variationskoeffizientunter 15%). Es wurde eine zufällige Mutagenesebibliothek von ASTB generiert und auf eine verbesserte Sulfatierungsaktivität des Glykosaminoglykan-Bausteins, N-Acetylglucosamin (GlcNAc) selektiert. Die Variante ASTB-V1 (Val579Asp) wurde identifiziert und zeigte mit einer 3,4-fach erhöhte spezifische Aktivität gegenüber GlcNAc im Vergleich zu ASTB-Wildtyp die größte Verbesserung. Des Weiteren wurde die ASTB in einer wissensbasierten Evolutionskampagne (KnowVolution) zu einer erhöhten Sulatierungsaktivität des Cellulosebaustein, Cellobiose evolviert. Die finale Rekombinationsvariante ASTB-M5 (Leu446Pro/Val579Lys) zeigte eine 7,6-fache Erhöhung der spezifischen Aktivität (6,15 U/mg) gegenüber Cellobiose. In einer computergestützten Analyse ergab, dass Leu446Pro in die Substratbindung involviert ist und identifizierte Val579Lys als eine distale Substitution vorliegt. Mit Hilfe der Massenspektrometry wurde gezeigt, dass sowohl GlcNAc als auch Cellobiose durch das Enzym monosulfatiert wurden. Die Strukturaufklärung mittels Kernspinresonanzspektroskopie bestätigte die partielle regioselektive Sulfatierung des GlcNAc-Linker-tBoc an den seltenen Positionen (C-3 oder C-4; C-6 wird durch chemische Methoden bevorzugt). Diese Ergebnisse stellen die erste erfolgreiche gelenkte Evolutionsrunde, gefolgt von KnowVolution, einer Arylsulfotransferase zur Sulfatierung von Sacchariden dar. Der Überfluss an Mikroplastik in Mülldeponien und in marinen Ökosystemen schädigt die dort lebenden Organismen und daher auf Dauer auch die Menschheit. Der natürliche Abbau der enthaltenen Polymere dauert je nach Größe und Art des Partikels mindestens 50 bis 100 Jahre. Anders als die als Kunststoff am häufigsten verwendeten synthetischen Polymere Polyethylen und Polypropylen, können Polyethylenterephthalat (PET) und Polyurethan (PUR) durch hydrolytische Enzyme biologisch abgebaut werden. So wird beispielsweise berichtet, dass Cutinasen sowohl PET als auch PUR abbauen. Dabei besteht die Herausforderung für die Enzyme darin, Mikroplastik-Partikel für die Depolymerisation unter natürlichen Bedingungen gezielt zu binden. Hydrolytische Enzyme (z. B. Cellulasen, Depolymerasen), die natürliche Polymere (z. B. Cellulose, Polyhydroxyalkanoat) abbauen können, besitzen eine sogenannte Substratbindedomäne. Diese bindet spezifisch an Polymeroberfläche und bringt die katalytische Domäne der Enzyme in die Nähe des Substrats. Inspiriert durch diese in der Natur angewandte Lösung, können Enzyme ohne Bindungsdomäne mit Materialbindepeptiden (z. B. Ankerpeptide, Hydrophobine, Cellulosebindungsdomänen) fusioniert werden, die eine starke Anbindung des Enzyms an Polymere wie PET und PUR ermöglichen. Der synthetische Polymerabbau wurde durch eine Cutinase mit Hilfe von Ankerpeptiden als Haftvermittler beschleunigt. Zwei Ankerpeptide, Liquid Chromatography Peak I (LCI) und Tachystatin A2 (TA2) wurden mit der bakteriellen Cutinase Tcur1278 fusioniert, um der Abbau von Polyester-PUR-Nanopartikeln und PET-Folien zu beschleunigen. Die Halbwertszeit der Polyester-PUR-Nanopartikel wurde von 41,8 h auf 6,2 h (6,7-fach) durch das Fusionsprotein Tcur1278-TA2 in einer verdünnten Suspension (0,057% w/v) reduziert. Die Analyse der der abgebauten Nanopartikel mit Hilfe der dynamischen Lichtstreuung (DLS) zeigte, dass die durch Tcur1278-TA2 abgebauten Partikel, im Vergleich zu Tcur1278-Wildtyp, eine kleinere Größe aufwiesen (von 0,33 nm auf 0,08 nm). Die Feldemissions-Rasterelektronenmikroskopie (FE-SEM) ermöglichte den Vergleich des Abbaus einer Polyester-PUR-Schicht durch Tcur1278 mit und ohne den Anker TA2. Darüber hinaus wurde das Prinzip des haftvermittelnden Abbaus von synthetischen Polymeren mittels Ankerpeptid auf das Polymer PET übertragen. Hier konnte ein 16-fach beschleunigter PET-Folienabbau durch Tcur1278-TA2 im Vergleich zu Tcur1278-Wildtyp dokumentiert werden. Diese Studie berichtet den ersten Nachweis eines gezielten und beschleunigten Abbaus durch den Einsatz, eines polymerabbauenden Enzyms, dass mit einem Ankerpeptide als Haftvermittler fusioniert wurde.

Enzymes are well-known as efficient catalysts for chemical reactions under mild conditions (ambient temperature, low pressure) with high chemo-, regio-, and enantioselectivity. Properties such as specific activity, stability, and resistance can be improved using protein engineering to tailor enzymes. This work reports the engineering of two different classes of enzymes (transferase and hydrolase) toward efficient functionalization of biopolymers and depolymerization of synthetic polymers, respectively. New functionalities can be introduced to polysaccharides by applying chemical and enzymatic technologies. Glycosaminoglycan (GAG) is one of the most important classes of functional polysaccharides found in nature. Natural GAGs are mainly isolated from animal sources leading to mass animal farming. Alternative to natural GAGs, chemically sulfated polysaccharide (e.g., cellulose) can mimic the functionalities of GAGs including anti-coagulant and anti-viral activity. Enzymatic sulfation by sulfotransferases in contrast to chemical sulfation offers a greener alternative to introduce sulfate groups to the building blocks of polysaccharides in aqueous solution, at ambient temperature, and with high chemo- and regioselectivity. Bacterial aryl sulfotransferases (ASTs) are interesting biocatalyst due to a broad acceptor range and cost-effective sulfate donors. Interestingly, ASTs are able to sulfate small saccharides (e.g., glucose) slowly. Therefore, tailoring of ASTs by protein engineering methods is needed to increase the activity of these enzymes for effective sulfation of saccharides, and later polysaccharides.The aryl sulfotransferase B (ASTB) from Desulfitobacterium hafniense was advanced toward a synthetically attractive sulfation agent for saccharides. A directed evolution protocol was developed and validated for ASTB. The well-known para-nitrophenylsulfate (pNPS) quantification system was extended to a continuous and robust screening system in 96-well MTP format with a true coefficient of variation below 15%. Firstly, a random mutagenesis library of ASTB was screened to identify variants with improved sulfation activity toward the GAG-building block N-acetylglucosamine (GlcNAc). The best-identified variant ASTB-V1 (Val579Asp) showed an up to 3.4-fold increased specific activity (U/mg) toward GlcNAc in comparison to ASTB-WT. Secondly, ASTB was further subjected to a knowledge-gaining directed evolution campaign (KnowVolution) toward the cellulose building block cellobiose. The final recombination variant ASTB-M5 (Leu446Pro/Val579Lys) resulted in a 7.6‐fold increase in specific activity (6.15 U/mg) toward cellobiose. Computational analysis discovered an important role of Leu446Pro in the substrate‐binding and suggested Val579Lys as a distal substitution. Mass spectrometry (MS) revealed a monosulfation of GlcNAc as well as cellobiose. Structure elucidation by nuclear magnetic resonance (NMR) confirmed the partial regioselective sulfation of GlcNAc‐linker‐tBoc at rare positions (C‐3 or C‐4), whereas C‐6 preferred is by chemical methods. These findings represent the first successful directed evolution campaign followed by KnowVolution of an AST for regioselective sulfation of saccharides. The abundance of microplastic in the landfill and marine environment causes harm to the living organisms and in long run to human race. A natural degradation of such polymer requires from 50 to 100 years or even more depending on the size and type. Other than the most commonly used synthetic polymers as plastics (e.g., polyethylene and polypropylene), polyethylene terephthalate (PET) and polyurethane (PUR) can undergo biodegradation by hydrolytic enzymes. For instance, cutinases are reported to degrade both PET and PUR. A challenging task for the enzymes is to target the microplastic particles for depolymerization under natural circumstances. Hydrolytic enzymes (e.g., cellulases and depolymerases) for natural polymers (e.g., cellulose and polyhydroxyalkanoate) appear with a so-called substrate-binding domain. The substrate-binding domain binds specifically to the polymeric material to bring the catalytic domain of the enzymes to its substrate. Inspired by nature’s solution, enzymes without binding domain can be fused to material-binding peptides (e.g., hydrophobins, cellulose binding domains, and anchor peptides), which bind strongly to polymers such as PET and PUR.Synthetic polymer degradation by a cutinase was accelerated using anchor peptides as adhesion promoters. Two anchor peptides, liquid chromatography peak I (LCI) and Tachystatin A2 (TA2) were fused to the bacterial cutinase Tcur1278 to accelerate the degradation of polyester-PUR nanoparticle and PET films. The half-life of polyester-PUR nanoparticles was reduced from 41.8 h to 6.2 h (6.7-fold) in a diluted suspension (0.057% w/v) by Tcur1278-TA2. Dynamic light scattering (DLS) revealed the smaller size of degraded nanoparticles (from 0.33 nm down to 0.08 nm) by Tcur1278-TA2 compared to Tcur1278-WT. Field emission scanning electron microscopy (FE-SEM) enabled the comparison of the degraded polyester-PUR nanoparticle layer by Tcur1278 with and without TA2. Furthermore, the principle of targeting synthetic polymer by anchor peptide was applied to PET. A 16-fold accelerated PET-foil degradation was documented by Tcur1278-TA2 compared to Tcur1278-WT. This study reports the first proof of principle of targeted and accelerated degradation by the usage of anchor peptides as adhesion promoters fused to a synthetic polymer degrading enzyme.

OpenAccess:
PDF
(additional files)