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001     758220
005     20230408005916.0
024 7 _ |2 HBZ
|a HT020010384
024 7 _ |2 Laufende Nummer
|a 38041
024 7 _ |2 datacite_doi
|a 10.18154/RWTH-2019-02768
037 _ _ |a RWTH-2019-02768
041 _ _ |a English
082 _ _ |a 570
100 1 _ |0 P:(DE-588)1181826217
|a Zou, Zhi
|b 0
|u rwth
245 _ _ |a Directed sortase evolution for site-specific protein engineering and surface functionalization
|c vorgelegt von Zhi Zou Master of Biochemistry and Molecular Biology
|h online
260 _ _ |a Aachen
|c 2019
300 _ _ |a 1 Online-Ressource (146 Seiten) : Illustrationen
336 7 _ |0 2
|2 EndNote
|a Thesis
336 7 _ |0 PUB:(DE-HGF)11
|2 PUB:(DE-HGF)
|a Dissertation / PhD Thesis
|b phd
|m phd
336 7 _ |2 BibTeX
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|a doctoralThesis
336 7 _ |2 DataCite
|a Output Types/Dissertation
336 7 _ |2 ORCID
|a DISSERTATION
500 _ _ |a Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University
502 _ _ |a Dissertation, RWTH Aachen University, 2019
|b Dissertation
|c RWTH Aachen University
|d 2019
|g Fak01
|o 2019-02-26
520 3 _ |a Die sortase-vermittelte Ligation (SML) hat sich als wichtiges Instrument für die ortsspezifische Biokonjugation im Protein-Engineering und in der Materialfunktionalisierung herausgebildet. Sortase A aus Staphylococcus aureus (Sa-SrtA) erkennt spezifisch ein LPxTG-Motiv (worin x eine beliebige Aminosäure bedeutet) im Zielprotein 1 und spaltet die scherige Amidbindung zwischen Threonin und Glycin. Das erzeugte Thioester-Zwischenprodukt ligiert anschließend an Oliglycin am N-Terminus an das Zielprotein 2. Trotz vieler Highlights in Anwendungen weist Wildtyp-Sa-SrtA einige bemerkenswerte Einschränkungen auf (z. B. eine relativ geringe katalytische Effizienz (hoher Km (LPxTG) ≈ 6,5 mM), eine strikte Spezifität für das LPxTG-Motiv und die Abhängigkeit von Calciumcofaktor). Directed Evolution ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Enzymeigenschaften auf benutzerdefinierte Ziele abzustimmen. Directed Sortase A Evolution erfordert die Entwicklung eines robusten Hochdurchsatz-Assays, der die gebildeten konjugierten Produkte direkt erfasst. Mehrere konjugierte Produkt-basierte Hochdurchsatz-Screening-Strategien (z. B. Zelloberflächenanzeige und In-vitro-Kompartimentierung) von Sa-SrtA wurden etabliert. Es wurden Varianten mit erhöhten Aktivitäten, veränderten Substratspezifitäten (anstelle des LPxTG-Motivs) und Calciumunabhängigkeit identifiziert. Diese Strategien sind jedoch eher spezifisch für das Engineering einer Eigenschaft von Sortase A und in der Regel in ihrer Vielseitigkeit eingeschränkt. Zu diesem Zweck war es wichtig, ein allgemeines, robustes und zuverlässiges Rastersystem im Mikrotiterplatten (MTP) -Format zu schaffen, das zur Durchführung gerichteter Sa-SrtA-Evolutionskampagnen für verschiedene Eigenschaften (z. B. Wärmestabilität und Lösungsmittelbeständigkeit) anwendbar ist. Um die Erforschung des Sortase-Engineerings voranzutreiben, konzentrierte sich diese Arbeit auf die Entwicklung eines allgemeinen Hochdurchsatz-Screening systems für Sortase A, die gerichtete Evolution von Sortase A für effiziente ortsspezifische Ligationen in organischen Lösungsmitteln und Anwendungen von Sortase A für kovalent Immobilisierung mehrerer Proteine auf Mikrogel. Im ersten Abschnitt wurde eine allgemein gerichtete Sortase-Entwicklungsplattform (SortEvolve) in einem 96-Well-MTP aus Polypropylen (PP-MTP) entwickelt. Für SortEvolve wurden zwei Anträge durchgeführt. In Anwendung 1 wurde SortEvolve für die gerichtete Sa-SrtA-Entwicklung validiert. In Anwendung 2 wurde SortEvolve für die gerichtete Entwicklung von CueO-Laccase mit minimiertem Hintergrundrauschen (um das 20fache verringert) validiert. SortEvolve stellt eine vergleichbare Menge / halb gereinigtes Enzym durch Immobilisierung in PP-MTP sicher. Letzteres ist vorteilhaft, um falsch positive Ergebnisse während des Screenings zu vermeiden, und eignet sich auch für gerichtete Entwicklungskampagnen, bei denen Hintergrundaktivität (oder Lärm) aus Rohlysat minimiert werden muss, um vorteilhafte Varianten zu identifizieren. Im nächsten Abschnitt wurde eine Sa-SrtA-Entwicklungskampagne (KnowVolution) für organische Lösungsmittel durchgeführt. Organische Lösungsmittel (z. B. DMSO, DMF) werden routinemäßig verwendet, um hydrophobe Verbindungen aufzulösen. Die Entwicklung von Sa-SrtA für verbesserte Beständigkeit / Aktivität in organischen Colösungsmitteln erleichtert SML für ein breiteres Spektrum an Substraten. Eine Zufallsmutagenesebibliothek (SeSaM-Bibliothek) von Sa-SrtA wurde in einem DMSO-Colösungsmittel durch ein modifiziertes SortEvolve-Protokoll gescreent. Im Vergleich zu Sa-SrtA wurden Sa-SrtA-Variante M1 (R159G) mit 2,2-fach verbesserter Beständigkeit und Variante M3 (D165Q / D186G / K196V) mit 6,3-fachem katalytischem Wirkungsgrad in 45% (v / v) DMSO-Colösungsmittel erhalten WT. Die Wechselwirkungen zwischen Sa-SrtA und DMSO wurden durch Molekulardynamik (MD) -Simulationen untersucht. Die MD-Simulationen zeigten, dass die Konformationsbeweglichkeit von Sa-SrtA für die gewonnene Resistenz und Aktivität im Colösungsmittel von DMSO wichtig ist. Die Anwendung von Sa-SrtA M3 wurde bei ortsspezifischen Konjugationen in organischen Colösungsmitteln ausgenutzt. Die Vielseitigkeit von SML in organischen Colösungsmitteln wurde durch Erzeugung von Peptid-Aminkonjugaten demonstriert. Sa-SrtA-M3 zeigte eine bis zu 4,7-fach erhöhte spezifische Aktivität (gegenüber Sa-SrtA-WT) für die ortsspezifische Konjugation von Peptid / primären Aminen in DMSO- und DMF-Colösungsmitteln. Im letzten Abschnitt wurde eine allgemeine kovalente Immobilisierungsplattform für Enzyme auf der Oberfläche eines Poly (N-vinylcaprolactam) / Glycidylmethacrylat (PVCL / GMA) -Mikrogels unter Verwendung von Sortase-vermittelter Ligation entwickelt. Die Vielseitigkeit der Plattform wurde durch Immobilisierung von fünf Enzymen (Lipase A, Phytase, Laccase, Cellulase und Monooxygenase) mit entweder einem N-terminalen GGG-Motiv oder einem C-terminalen LPxTG auf der Oberfläche des pVCL / GMA-Mikrogels nachgewiesen. Anschließend wurden die kinetischen Parameter, Lösungsmittelbeständigkeit, pH-Profil, Thermostabilität und Wiederverwendbarkeit von immobilisierter CueO-Laccase und P450-BM3-Monooxygenase auf PVCL / GMA-Mikrogel untersucht. Beeindruckend zeigten immobilisiertes CueO und P450 BM3 im Vergleich zu entsprechenden freien Enzymen (z. B. P450 BM3-Monooxygenase, CueO-Laccase) eine bis zu 4-fach verbesserte Resistenz im Colösungsmittel von DMSO. Das hochstabile immobilisierte CueO wurde bei der Entfärbung aromatischer Farbstoffe mit hoher Effizienz und Reusab weiter genutzt.
|l ger
520 _ _ |a Sortase-mediated ligation (SML) has emerged as a improtant tool for site-specific bioconjugation in protein engineering and material functionalization. Sortase A from Staphylococcus aureus (Sa-SrtA) specifically recognizes an LPxTG (in which x means any amino acid) motif in the target protein 1 and cleaves the scissile amide bond between threonine and glycine. The generated thioester intermediate subsequently ligates to the target protein 2 with oligo glycine at N-terminal. Despite many highlights in applications, wild type Sa-SrtA suffers from several notable limitations (e.g. a relatively low catalytic efficiency (high Km (LPxTG) ≈ 6.5 mM), a strict specificity for the LPxTG motif and dependency on calcium cofactor). Directed evolution is a powerful tool to tailor enzyme properties towards user-defined goals. Directed sortase A evolution requires the development of a robust high-throughput assay which directly detects the formed conjugated products. Several conjugated product-based high-throughput screening strategies (e.g. cell surface display and in vitro compartmentalization) of Sa-SrtA have been established. Variants with enhanced activities, altered substrate specificities (rather than LPxTG motif) and calcium-independence were identified. However, these strategies are rather specific for engineering of one property of sortase A and usually limited in versatilities. For such purpose, it was essential to establish a general, robust and reliable screening system in microtiter plate (MTP) format which is applicable to perform directed Sa-SrtA evolution campaigns for different properties (e.g. thermos-stability and solvent resistance). In order to advance research of sortase engineering, this thesis was focused on the development of a general high-throughput screening system of sortase A, directed evolution of sortase A for efficient site-specific ligations in organic solvents, and applications of sortase A for covalent immobilization of multiple proteins on microgel. In the first section, a general directed sortase evolution platform (SortEvolve) was developed in in 96-well MTP made of polypropylene (PP-MTP). Two applications were carried out for SortEvolve. In Application 1, SortEvolve was validated for the directed Sa-SrtA evolution. In Application 2, SortEvolve was validated for the directed evolution of CueO laccase with minimized background noise (20-fold decreased). SortEvolve ensures a comparable amount/semi-purified enzyme through immobilization in PP-MTP. The latter is beneficial to avoid false positives during screening and also suited for directed evolution campaigns in which background activity (or noise) from crude lysate has to be minimized in order to identify beneficial variants In the next section, directed Sa-SrtA evolution campaign (KnowVolution) towards organic solvents was implemented. Organic solvents (e.g. DMSO, DMF) are routinely used to dissolve hydrophobic compounds. Engineering of Sa-SrtA for improved resistance/activity in organic co-solvents facilitates SML for more broad range of substrates. A random mutagenesis library (SeSaM library) of Sa-SrtA was screened in DMSO co-solvent by a modified SortEvolve protocol. Sa-SrtA variant M1 (R159G) with 2.2-fold improved resistance and variant M3 (D165Q/D186G/K196V) with 6.3-fold catalytic efficiency in 45% (v/v) DMSO co-solvent were obtained when compared with Sa-SrtA WT, respectively. Interactions of between Sa-SrtA and DMSO were investigated by molecular dynamic (MD) simulations. The MD simulations revealed that conformational mobility of Sa-SrtA is important for the gained resistance and activities in the co-solvent of DMSO. Application of Sa-SrtA M3 has exploited in site-specific conjugation in organic co-solvents. Versatility of SML in organic co-solvents was demonstrated by generating peptide-amines conjugates. Sa-SrtA M3 showed an up to 4.7-fold increased specific activity (vs Sa-SrtA WT) for site-specific conjugation of peptide/primary amines in DMSO and DMF co-solvents. In the last section, a general covalent immobilization platform of enzymes on the surface of Poly (N-vinylcaprolactam)/Glycidyl methacrylate (PVCL/GMA) microgel was developed using sortase-mediated ligation. Versatility of the platform was proved by immobilization of five enzymes (lipase A, phytase, laccase, cellulase, and monooxygenase) with either N-terminal GGG motif or C-terminal LPxTG on surface of pVCL/GMA microgel. The kinetic parameters, solvents resistance, pH profile, thermo-stability and reusability of immobilized CueO laccase and P450-BM3 monooxygenase on PVCL/GMA microgel were subsequently investigated. Impressively, immobilized CueO and P450 BM3 showed an up to 4-fold improved resistance in the co-solvent of DMSO in comparison to corresponding free enzymes (e.g. P450 BM3 monooxygenase, CueO laccase). The highly stable immobilized CueO was further exploited in decolourization of aromatic dyes with high efficiency and reusability.
|l eng
588 _ _ |a Dataset connected to Lobid/HBZ
591 _ _ |a Germany
653 _ 7 |a bioconjugation
653 _ 7 |a directed evolution
653 _ 7 |a site-specific
653 _ 7 |a sortase
653 _ 7 |a surface functionalization
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|a Schwaneberg, Ulrich
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|a Pich, Andrij
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Marc 21