Investigations on the use of defined co-cultures for the consolidated bioprocessing of cellulose to itaconic acid

Schlembach, Ivan Bernd Maria; Blank, Lars M.; Agler-Rosenbaum, Miriam

doi:38666

Investigations on the use of defined co-cultures for the consolidated bioprocessing of cellulose to itaconic acid

Schlembach, Ivan Bernd Maria^RWTH*

2019

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von M. Sc. Biologie Ivan Schlembach

ImpressumAachen 2019

Dissertation, RWTH Aachen University, 2019

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Agler-Rosenbaum, Miriam (Thesis advisor) ; Blank, Lars M. (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2019-02-13

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2019-10011
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/771236/files/771236.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Aspergillus terreus (frei) ; Biomasse (frei) ; itaconic acid (frei) ; Itakonsäure (frei) ; TMFB (frei) ; Trichoderma reesei (frei) ; Zellulose (frei) ; bioconversion (frei) ; biofuel (frei) ; biomass (frei) ; cellulase (frei) ; cellulose (frei) ; consolidated bioprocessing (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Pflanzliche Biomasse ist ein nahezu unerschöpflicher nachwachsender Rohstoff und hat das Potential fossile Rohstoffe für die nachhaltige Produktion von Kraftstoffen, diversen Polymeren und anderen Chemikalien zu ersetzen. Ein wichtiger Zwischenschritt dabei ist die Umwandlung von Lignocellulose in sogenannte „Plattform-Chemikalien“, welche dann als Vorstufen für die Produktion verschiedenster Endprodukte dienen können. Die Größte Herausforderung dabei ist die große Widerstandsfähigkeit von Lignocellulose gegenüber chemischen und biologischen Transformationsprozessen. Ein mögliches Konzept für die Verwertung von Lignocellulose ist die enzymatische Verzuckerung der darin enthaltenen Polysaccharide in monomere Zuckereinheiten, welche anschließend als Substrat für diverse Fermentationsprozesse dienen können. Obwohl technisch möglich, ist dieser Prozess jedoch ökonomisch wenig effizient. Die Notwendigkeit dreier separater Prozessschritte (Produktion cellulolytischer Enzyme, Verzuckerung des Ausgangsmateriales und Fermentation der gewonnen Zucker zum Zielprodukt) verursacht hohe Kosten. Die Implementierung aller drei Prozesse in einen einzigen konsolidierten Bioprozess (CBP) wird daher als Schlüsseltechnologie angesehen, um die Nutzung von Lignocellulose ökonomisch rentabel zu machen.Das Ziel dieser Arbeit war die Etablierung eines CBP für die direkte Umwandlung von Cellulose in die Plattform-Chemikalie Itakonsäure. Da kein einzelner Organismus bekannt ist, welcher sowohl ausreichend cellulolytische Enzyme als auch Itakonsäure produzieren kann, stand die Etablierung einer Mischkultur hierbei im Fokus. Diese sollte aus einem spezialisierten Cellulase-Produzenten und einem spezialisierten Itakonsäure-Produzenten bestehen. Dabei wurde der zurzeit bereits industriell genutzte Pilz Aspergillus terreus nach anfänglichem Vergleich alternativer Mikroorganismen als Itakonsäure-Produzent ausgewählt. Die Itakonsäure-Produktion mit A. terreus erfordert jedoch die Erfüllung spezieller Grundvoraussetzungen. Diese Umfassen einen strikten Manganmangel, einen niedrigen fermentations-pH, eine hohe initiale Zuckerkonzentration und eine ununterbrochene Sauerstoffversorgung. Daher wurde zunächst ausgearbeitet, welche Probleme sich bei der Erfüllung dieser Voraussetzungen in dem angestrebten CBP Prozess ergeben und wie diese gelöst werden können.Dabei konnte gezeigt werden, dass die starke Sensitivität gegenüber Mangan eine außergewöhnlich hohe Reinheit der Cellulose Substrate erfordert. Mangankonzentration von nur 22 µg/L reduzierten die Itakonsäure Produktion bereits um mehr als 90%. Reine α-Cellulose in Laborqualität enthielt genügend Mangan um die Itakonsäure Produktion komplett zu inhibieren. Die einzige Möglichkeit, in Gegenwart von α-Cellulose Itakonsäure zu produzieren war daher eine intensive Aufreinigung der Cellulose mithilfe von verdünnter Schwefelsäure, welche das Mangan effektiv aus der Cellulose entfernte. Da der optimale pH-Wert zur Produktion von Itakonsäure (pH 3.4) weit niedriger ist als der optimale pH kommerzieller Cellulase Enzyme (4.5), wurde nach alternativen Cellulase Produzenten gesucht, welche besser an einen solch niedrigen pH angepasst sind. Hierbei wurde Penicillium verruculosum als eine viel versprechende Alternative zu dem besten öffentlich verfügbaren Cellulase Produzenten Trichoderma reesei Rut-C30 identifiziert. In Schüttelkolbenversuchen erreichte P. verruculosum höhere Zuckerfreisetzungsraten, eine schnellere Enzyminduktion und eine verbesserte Cellobiase Aktivität unter den anvisierten Prozessbedingungen. Ein weiteres Problem stellte jedoch der zur Initiation der Itakonsäure Produktion in A. terreus notwendige pH von unter 2 dar. Untersuchungen ergaben, dass ein solch niedriger pH die Cellulase Enzyme sowohl von T. reesei als auch von P. verruculosum irreversibel inaktiviert. Auch die Voraussetzung einer Zuckerkonzentration von über 120 g/L zur effizienten Induktion der Itakonsäure Produktion war inkompatibel mit dem angestrebten CBP Konzept. Eine solche Zuckermenge ist jedoch erforderlich, um eine hohe Ausbeute an Itakonsäure mit A. terreus zu gewährleisten. Im Zuge dieser Arbeit wurden neue Methoden zur Vorhersage und Messung der Zuckerfreisetzungsrate während eines CBP entwickelt. Der Einfluss der Cellulose Konzentration und des Enzyme/Substrat Verhältnisses wurden systematisch untersucht. Die Zuckerfreisetzungsrate verhält sich dabei direkt proportional zur Cellulose Konzentration, jedoch lediglich proportional zum Logarithmus des Enzyme/Substrat Verhältnisses. Daher ist die Erhöhung der Zellulose Konzentration während des Prozesses die effektivste Möglichkeit die Zuckerfreisetzrate zu erhöhen. Die praktisch nutzbare Cellulose Konzentration wird jedoch durch die hydro-mechanischen Eigenschaften der Cellulose-Schlämme beschränkt. Die Erhöhung der Feststoffkonzentration erschwert das gleichmäßige mischen und belüften des Reaktors. Dies steht im direkten Konflikt mit der zuvor erwähnten Grundvoraussetzung der Itakonsäure Produktion, eine kontinuierliche Sauerstoffversorgung zu gewährleisten. Ohne Sauerstoff kann die Produktion innerhalb von Minuten zum Erliegen kommen. Des Weiteren wurde die Cellulose-Verdaubarkeit als ein dritter Faktor identifiziert, welcher die Zuckerfreisetzrate stark beeinflusst. Es wurde gezeigt, dass die Verdaubarkeit der Cellulose im Verlauf der Kultivierung drastisch sinkt, dieser Effekt stellt damit ein Hauptproblem zur Erhaltung einer kontinuierlich hohen Zuckerfreisetzungsrate dar. Auch unter optimistischen Annahmen und bei Einsatz außergewöhnlich hoher Enzymmengen von über 250 FPU/g ist daher eine Akkumulation ausreichend hoher Zuckerkonzentrationen unwahrscheinlich.Um einigen der erwähnten Herausforderungen zu begegnen, wurde versucht die angestrebte Co-Kultur sequenziell durchzuführen. Zunächst wurde der Cellulase-Produzent im Fed-batch Betrieb kultiviert, um hohe Cellulase Titer zu akkumulieren. Anschließend wurden große Mengen säure gewaschener Cellulose zugegeben und die Fermentationstemperatur erhöht, um vermehrt Zucker freizusetzen. Zuletzt wurde eine vor-induzierte Vorkultur von A. terreus zugegeben, die mit einer Glukosekonzentration von 125 g/L und unter niedrigen pH Bedingungen angezogen wurde. Als cellulolytische Partner Organismen dienten hierbei jeweils entweder T. reesei oder P. verruculosum. Obwohl hohe Cellulase Titer von mehr als 11 FPU/mL erreicht wurden und Cellulose-Konzentrationen von bis zu 120 g/L eingesetzt wurden, konnte nur maximale Zuckermengen von 22.5 g/L und 0.3 g/L Itakonsäure produziert werden. Die P. verruculosum enthaltende Co-kultur produzierte keine nachweisbare Menge an Itakonsäure. Neben den allgemeinen Produktionseigenschaften der Einzelorganismen, sind auch Ihre Interaktionsmuster entscheidend. Es wurden verschiedene Methoden entwickelt, um die Populationsdynamik in einer Model Co-Kultur zwischen A. terreus und T. reesei voneinander unabhängig zu quantifizieren. Beide Organismen wurden durch rekombinante Expression verschiedenfarbiger Fluoreszenzproteine markiert. Fluoreszenzmikroskopische Bildanalyse und online Fluoreszenz Messungen erwiesen sich als günstige und schnelle Methoden zur Untersuchung von Mischkulturen. Die generierten Resultate wurden durch unabhängige qPCR-basierte Messungen validiert. Die Untersuchungen zeigten, dass weder T. reesei noch P. verruculosum eine stabile Mischkultur zusammen mit A. terreus bilden. Stattdessen wurde jeweils einer der beiden Organismen verdrängt. A. terreus ist dabei dominanter als T. reesei, während P. verruculosum zur Verdrängung von A. terreus führt. Die präsentierten Resultate belegen, dass ein A. terreus basierter CBP nicht praktikabel ist, außer alle hier erwähnten Herausforderungen werden zuvor gelöst. Stattdessen sollten andere Organismen untersucht werden, die in der Lage sind Itakonsäure unter Bedingungen zu produzieren, welche besser mit den Prinzipien eines CBPs vereinbar sind. In diesem Zusammenhang wurden erste Tests mit einem genetisch modifizierten Ustilago maydis Stamm durchgeführt. Dieser alternative Itakonsäure-Produzent zeigte dabei vielversprechende Ergebnisse im Zuge einer simultanen Verzuckerung und Fermentation (SSF). So konnten sowohl unter Verwendung von leichtverdaulicher Sigmacell Cellulose als auch mit der schwer verdaulichen α-Cellulose mehr als 18 g/L Itakonsäure direkt produziert werden. Dies ist der höchste bisher dokumentierte Itakonsäure Titer, welcher je im SSF Aufbau erzielt wurde. Weiterhin wurden im Rahmen dieser Arbeit wichtige neue Methoden zum generellen Aufbau und zur Charakterisierung von Mischkultur basierten CBP entwickelt, welche nun für die zukünftige Entwicklung neuer CBPs zur Verfügung stehen.

Lignocellulosic biomass is the most abundant renewable resource on earth and holds the potential to replace fossil resources as sustainable substrate for the production of fuels, various polymers and other chemicals. An important intermediate step for the valorisation of lignocellulose in this context, is the conversion into platform chemicals, which serve as precursors for the production of a broad range of final products. However, the major barrier thereby is the high recalcitrance of lignocellulose towards chemical and biological transformation. One concept is the enzymatic saccharification of lignocellulosic polysaccharide constituents into monomer sugars, which can then be used as substrates for various fermentative transformations. Although technically possible, the economic feasibility is affected by the high costs associated with the execution of three separate processes; the production of cellulolytic enzymes, the saccharification of the lignocellulosic feedstock and the fermentation of the resulting sugars into the target product. Therefore, the combination of these three sub-processes into a single consolidated bioprocess (CBP) is expected to be a key technological breakthrough to make lignocellulose valorisation economically viable. The aim of this thesis was the development of a consolidated bioprocess for the direct conversion of cellulose to the platform chemical itaconic acid. Because no organism is available that can efficiently produce cellulolytic enzymes and itaconic acid at once, the development of a mixed culture consisting of a specialized itaconic acid producer and a specialized cellulase producer was targeted. After an initial assessment of available itaconic acid producing organisms, the currently industrially applied fungus Aspergillus terreus was selected. However, it is known that A. terreus only produces itaconic acid when the prerequisites of a strict manganese deficiency, a low fermentation pH, a high initial sugar concentration and a non-interrupted oxygen supply are fulfilled. As a first step to elaborate the most feasible process setup, the challenges associated with the fulfilment of these prerequisites in a CBP scenario were investigated and the possibilities to overcome these challenges were explored.It was found that the extreme sensitivity towards manganese precludes the use on non-purified substrates. Manganese concentrations as low as 22 µg/L reduced the itaconic acid yield by more than 90% and laboratory grade α-cellulose pulp was shown to contain enough manganese to completely inhibit itaconic acid production. Itaconic acid production in presence of cellulose was only possibly after extensive washing of the pulp using dilute sulfuric acid. As the optimum itaconic acid production pH of 3.4 is far more acid than the optimum cellulose hydrolysis pH of 4.5 used with commercial cellulase enzymes, alternative cellulase producers that were better adapted to the low pH conditions were screened. Penicillium verruculosum was thereby identified as promising alternative to the best publicly availably cellulase producer Trichoderma reesei Rut-C30, showing higher sugar release rates, faster enzyme induction and improved cellobiase activity under the targeted process conditions. However, for induction of itaconic acid production, the A. terreus culture has to experience a pH below 2 during the initial growth and it was found that such low pH irreversibly inactivates the cellulase enzymes of both T. reesei and P. verruculosum. Furthermore, the need for sugar concentrations above 120 g/L to induce high yield itaconic acid production was found incompatible with CBP. New methods were developed to predict and measure the sugar release during CBP. By systematically analysing the influence of cellulose concentration and enzyme/substrate ratio, it was found that the sugar release rate was directly proportional to the cellulose concentration but only proportional to the logarithm of the enzyme/substrate ratio. Therefore, the sugar release rate can be most effectively increased by increasing the cellulose concentration in the process. The practically usable cellulose concentration is however limited by the hydro-mechanical properties of the cellulose slurry. With increasing solids concentration, the slurry becomes hard to mix and aerate. This especially impedes the fulfilment of a non-interrupted oxygen supply, which can block itaconic acid production within a few minutes. Furthermore, the importance of cellulose digestibility was highlighted as a third factor to increase the sugar release rate and a drastic decrease in cellulose digestibility over the cultivation time was identified as central barrier for continuous cellulose hydrolysis at a high rate. Therefore, even under optimistic assumptions and application of extreme enzyme loadings of more than 250 FPU/g, an accumulation of high sugar concentrations in unlikely.It was attempted to partially solve the described challenges by performing the targeted co-culture in a sequential manner. First, the cellulase producer was cultivated in fed-batch mode to accumulate a high cellulase titre, then large amounts of cellulose were added to the culture and the fermentation temperature was increased to achieve an accumulation of sugars. Finally, a pre-induced pre-culture of A. terreus, that was grown at a starting glucose concentration of 125 g/L and that experienced low pH phase was introduced. This strategy was performed for both a T. reesei and a P. verruculosum based co-culture with A. terreus. However, despite reaching high cellulase titres of more than 11 FPU/mL and using cellulose concentrations as high as 120 g/L, the maximum achieved sugar accumulation was only 22.5 g/L and only 0.3 g/L of itaconic acid were produced in case of the T. reesei based co-culture. The P. verruculosum co-culture produced no itaconic acid.Besides the general production capabilities of the single mixed culture organisms, also their interaction pattern is of critical importance. Different methods to independently quantify the population dynamics between a model co-culture consisting of A. terreus and T. reesei were developed and compared. Both organisms were genetically engineered to express different fluorescence proteins. Especially fluorescence microscopic image analysis and online fluorescence measurements were found suitable to study co-culture interactions in a cheap and fast manner. The gathered results were validated using an independent qPCR based method. By investigating the population dynamics between A. terreus and the cellulolytic mixed culture partners T. reesei or P. verruculosum, it was found that neither of the two combinations evolves into a stable mixed culture, instead the more dominant organism displaces the inferior partner. Thereby, A. terreus was found more dominant than T. reesei, while P. verruculosum was found more dominant than A. terreus.The presented results clearly point out, that unless all of the described challenges will be overcome in future, an A. terreus based consolidated bioprocess will not be feasible. Instead, other organisms should be investigated whose itaconic acid production conditions do not contradict the principles of CPB. In this regard, promising results were gathered in a simultaneous saccharification and fermentation (SSF) setup using an engineered strain of the alternative itaconic acid producer Ustilago maydis. More than 18 g/L of itaconic acid could be directly produced from both amorphous Sigmacell and more crystalline α-cellulose, which is the highest reported titre ever achieved in an SSF setup.Although the initial goal of establishing an effective mixed culture CBP for the direct production of itaconic acid from cellulose could not be fulfilled yet, important new methods for the general setup and characterization of mixed culture based consolidated bioprocesses were developed that can be applied in future for the development of other CBP processes.

OpenAccess:
PDF
(additional files)