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Die Untersuchung von Allicin aus Knoblauch als Alternative zu konventionellen Antibiotika = Investigation of allicin from garlic as an alternative to conventional antibiotics



Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Jana Reiter, M.Sc. Biologie

ImpressumAachen 2020

Umfang1 Online-Ressource (297 Seiten) : Illustrationen, Diagramme


Dissertation, RWTH Aachen University, 2020

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University


Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
;

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2020-01-09

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2020-01379
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/781590/files/781590.pdf

Einrichtungen

  1. Lehrstuhl und Institut für Biologie III (Pflanzenphysiologie) (161510)
  2. Fachgruppe Biologie (160000)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
DNA gyrase (frei) ; Pseudomonas (frei) ; Streptococcus (frei) ; allicin (frei) ; garlic (frei) ; lung infection (frei) ; lung model (frei) ; lung pathogenic bacteria (frei) ; redox (frei) ; volatile antimicrobial agent (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Allicin ist eine antimikrobiell wirksame Substanz, die bei der Verletzung des Knoblauchgewebes zum Schutz vor pathogenen Mikroorganismen und Schädlingen entsteht. Allicin zählt zur Gruppe der reaktiven Schwefel-Spezies (RSS) und oxidiert zelluläre Thiole, wie z.B. Cystein-Reste in Proteinen oder den Redox-Puffer Glutathion (GSH). Diese Oxidation kann die enzymatische Aktivität beeinflussen bzw. die Funktionalität inhibieren, und sogar bei höheren Konzentrationen zum Zelltod führen. In Rahmen dieser Arbeit wurde der Frage nachgegangen, ob Allicin grundsätzlich das Potenzial zum Einsatz als Antibiotikum zur Behandlung bakterieller Lungeninfektionen in der Medizin hat. Die Oxidationsziele des Allicins wurden mithilfe der differenziellen Isotopen-kodierten Markierungsmethode OxICAT im bakteriellen Proteom identifiziert. Das Proteom des Allicin-anfälligen Pf0-1 und des Allicin-resistenten PfAR-1 wurden nach der Behandlung mit subletalen Allicin-Mengen miteinander verglichen. Bei der Kontrolle liegen die Proteine überwiegend im reduzierten Zustand vor: bei 77% der Proteine liegen Cysteine bis zu 20% oxidiert vor. Nach Allicin-Behandlung erhöht sich der Anteil der oxidierten Proteine: nur 54% der Proteine in dem Allicin-anfälligen Pf0-1, aber 66% der Proteine in dem Allicin-resistenten PfAR-1 bleiben zu weniger als 20% oxidiert. Als einer der spezifisch oxidierten Proteine wurde die Untereinheit A der DNA-Gyrase (GyrA) identifiziert. DNA-Gyrase ist ein bekannter Angriffsort für Antibiotika, da dieses Enzym nur in prokaryotischen Zellen vorkommt. Cys433 in GyrA liegt bei der Kontrolle nur zu 6% oxidiert vor. Nach Allicin-Behandlung steigt der Anteil des oxidierten Cys433 in dem Allicin-anfälligen Pf0-1 bis zu 56%, aber nur bis zu 11% in dem Allicin-resistenten PfAR-1. Allicin inhibierte die Aktivität der DNA-Gyrase aus E. coli in dem gleichen Konzentrationsbereich wie Nalidixinsäure, der erste entdeckte DNA-Gyrase-Inhibitor, bei in vitro Experimenten. Auf gereinigtes DNA-Gyrase-Enzym aus PfAR 1 und Pf0 1 wurde in in vitro Versuchen bei ähnlichen Allicin-Konzentrationen inhibiert. Der Austausch des gyrA-Gens in Pf0-1 durch das aus PfAR-1 führte zur höheren Anfälligkeit gegenüber Allicin in Vergleich zum Pf0-1 Wildtyp. Dies bedeutet, dass GyrA aus PfAR-1 keine erhöhte Allicin-Resistenz per se vermittelt und nicht für Allicin-Resistenz des PfAR-1 Stammes verantwortlich ist. Vielmehr ist es der genetische Hintergrund des PfAR-1 Stammes, der die DNA-Gyrase vor Oxidation durch Allicin schützt. Die Wirksamkeit des Allicins im Flüssigkultur gegenüber mehreren lungenpathogenen Bakterien-Stämmen (Acinetobacter, Klebsiella, Pseudomonas, Streptococcus und Staphylococcus) unter anderem auch MDR-Stämmen (engl. multiple drug resistant), wurde gezeigt. Die minimalen hemmenden und bakteriziden Konzentrationen (MHK und MBK) wurden unter den standardisierten Bedingungen von EUCAST (engl. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) bestimmt und mit den Werten von konventionellen Antibiotika verglichen. Die zytotoxische Wirkung des Allicins wurde auf menschliche Lungen- und Darm-Epithelzellen und auf murine Fibroblasten-Zellen in vitro und in Gegenwart der protektiven Wirkung des GSH gezeigt. In Gewebeschnitten der Rattenlunge verringert sich die Sensitivität gegenüber Allicin bei GSH-Zugabe in Blutplasma-ähnlichen Konzentration von 1 mM. Dadurch, dass Allicin das bakterielle Wachstum von mehreren lungenpathogenen Bakterien (Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus pneumoniae und Haemophilus influenzae) über die Gasphase inhibiert, bietet sich die direkte Inhalation des Allicins für die Behandlung der Lungeninfektionen an. Da bis jetzt noch keine gasförmigen Antibiotika zur Behandlung von Lungen-Infektionen verwendet werden, wäre Allicin, auch in den subletalen Konzentrationen, in Kombination mit oral-aufgenommenen konventionellen Antibiotika eine denkbare Ergänzung zu den aktuellen Behandlungsmöglichkeiten. Um die Allicin-Behandlung der infizierten Lungen zu simulieren wurde ein Lungen-Modell in Kooperation mit dem Aerodynamischen Institut der RWTH Aachen, das die menschlichen Bronchien der 2. bis 5. Generation darstellt, entwickelt. Die innere Fläche des Modells war mit 1 mm-dickem E. coli-haltigen Agar zur Simulation der bakteriellen Infektion beschichtet. Die Verwendung des Lungenmodells erlaubt das Beobachten der Ablagerung des antibiotisch wirksamen Aerosols an der „Bronchien“-Oberfläche des Modells ohne Notwendigkeit der Tierversuche. Die differenzielle Sensitivität der Test-Bakterien zu den verschiedenen Antibiotika sowie die konzentrationsabhängige Wachstumsinhibition wurden bei der Verwendung des Modells gezeigt. Bei der Behandlung der Bakterien über die Gasphase wurde der synergistische Effekt des Allicins mit Ethanol beobachtet. Die modellierte Luft-Strom-Geschwindigkeit innerhalb des Modells korreliert mit den Regionen, in denen das bakterielle Wachstum zuerst inhibiert wird. Dies lässt darauf schließen, dass das Lungen-Modell vorhersehbare Ergebnisse liefert und deren Verwendung bei initialen Untersuchungen und präklinischen Studien die Anzahl der notwendigen Tierversuche reduzieren kann.

Allicin is an antimicrobial substance, produced by garlic tissue upon wounding as a defence against pathogens and pests. Allicin is a reactive sulfur species (RSS) that oxidizes accessible cysteines in proteins and the redox buffer glutathione (GSH), thus inhibiting essential enzymes, and if the concentration is high enough, causing cell death. The aim of this work was to investigate allicin’s potential for medical use as an antibiotic for the treatment of bacterial lung infections. A differential isotopic labelling method (OxICAT) was used to identify allicin targets in the bacterial proteome. The proteomes of allicin-susceptible Pseudomonas fluorescens Pf0 1 and allicin-resistant PfAR 1 were compared after sublethal allicin exposure. Before exposure to allicin, proteins were in a predominantly reduced state, with approximately 77% of proteins showing less than 20% cysteine oxidation. Protein oxidation increased after exposure to allicin, and only 54% of proteins from allicin-susceptible Pf0 1, but 66% from allicin-tolerant PfAR 1, remained less than 20% oxidised. DNA gyrase was one of the proteins oxidized by allicin. Because it is only found in prokaryotes, DNA gyrase is a popular candidate target for antibiotics. Cys433 in DNA gyrase subunit A (GyrA) was approximately 6% oxidized in untreated bacteria, however, after allicin treatment the degree of Cys433 oxidation increased to 56% in sensitive Pf0 1 but only to 11% in resistant PfAR 1. Allicin inhibited E. coli DNA gyrase activity in vitro in the same concentration range as nalidixic acid, the first described DNA gyrase inhibitor. Purified PfAR 1 DNA gyrase was inhibited to greater extent by allicin in vitro than the Pf0 1 enzyme. Substituting PfAR 1 GyrA into Pf0 1 rendered the exchange mutants more susceptible to allicin than the Pf0 1 wild type. Taken together, these results suggest that GyrA was protected from oxidation in vivo in the allicin-resistant PfAR 1 background, rather than the PfAR 1 GyrA subunit being intrinsically less susceptible to oxidation by allicin than the Pf0 1 GyrA subunit per se. The growth inhibitory effect of allicin to clinical isolates of lung pathogenic bacteria from the genera Acinetobacter, Klebsiella, Pseudomonas, Streptococcus, and Staphylococcus, including MDR (multiple drug resistant) strains, was demonstrated. Minimal inhibitory (MIC) and minimal bactericidal concentrations (MBC) were determined and compared to clinical antibiotics using standard EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) procedures. The cytotoxicity of allicin to human lung and colon epithelial and murine fibroblast cells was tested in vitro and shown to be ameliorated by glutathione (GSH). Similarly, the sensitivity of rat precision-cut lung slices (PCLS) to allicin was decreased by raising the [GSH] to the approximate blood plasma level of 1 mM. Because allicin inhibited bacterial growth (Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus pneumoniae and Haemophilus influenzae) as a vapour, it could be used to combat bacterial lung infections via direct inhalation. Since there are no volatile antibiotics available to treat pulmonary infections, allicin, particularly at sublethal doses in combination with oral antibiotics, could make a valuable addition to currently available treatments. For the simulation of the allicin treatment of infected lungs, a lung model was developed in cooperation with Institute of Aerodynamics (RWTH Aachen University). The lung model represents the human lung from the 2nd to the 5th bronchial generation. To simulate bacterial infection the inner model surface was covered with 1 mm thick bacteria-seeded agar layer. The deposition of antimicrobial aerosols on the modelled bronchial surfaces was followed in preliminary tests without the need for animal experiments. The differential sensitivity of the test bacteria to different antibiotics and the dose-dependency of inhibition was shown using the model. Furthermore, a synergistic effect of allicin vapour and ethanol in inhibiting bacterial growth was demonstrated. The modelling of the axial velocity air-flow distribution correlated with the regions showing inhibition of bacterial growth, demonstrating that the model has predictive value and can reduce the requirement for animal sacrifice in pre-clinical trials of novel antibiotics.

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Dokumenttyp
Dissertation / PhD Thesis

Format
online

Sprache
German

Externe Identnummern
HBZ: HT020351397

Interne Identnummern
RWTH-2020-01379
Datensatz-ID: 781590

Beteiligte Länder
Germany

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The record appears in these collections:
Document types > Theses > Ph.D. Theses
Faculty of Mathematics, Computer Science and Natural Sciences (Fac.1) > Department of Biology
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160000
161510

 Record created 2020-01-28, last modified 2023-04-08


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