Characterisation of protein-protein interactions of membrane proteins from Hordeum vulgare and Arabidopsis thaliana involved in plant immunity

Sabelleck, Björn; Panstruga, Ralph; Schaffrath, Ulrich

doi:39139

Characterisation of protein-protein interactions of membrane proteins from Hordeum vulgare and Arabidopsis thaliana involved in plant immunity = Charakterisierung von Protein-Protein-Interaktionen von Membranproteinen aus Hordeum vulgare und Arabidopsis thaliana beteiligt an der Pflanzenabwehr

Sabelleck, Björn^RWTH*

2019 & 2020

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Björn Sabelleck, M.Sc.

ImpressumAachen 2019

Umfang1 Online-Ressource (264 Seiten) : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, RWTH Aachen University, 2019

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University 2020

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Panstruga, Ralph (Thesis advisor)^RWTH* ; Schaffrath, Ulrich (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2019-11-12

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2020-02792
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/784868/files/784868.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Arabidopsis thaliana (frei) ; plant immunity (frei) ; protein-protein interaction (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Pflanzen besitzen ein komplexes Immunsystem, welches fähig ist eine Pflanze gegen eine Vielzahl von Mikroben zu verteidigen. Um verschiede Mikroben wahrzunehmen, haben Pflanzen Rezeptor-ähnliche Kinasen und Rezeptor-ähnliche Proteine entwickelt, welche in der Plasmamembran lokalisiert sind. Diese Rezeptoren binden mikrobenspezifische Moleküle an der extrazellulären Seite und können ein Signal durch Phosphorylierungsreaktionen in ein zelluläres Signal umwandeln. Eine Abwehrsignalkaskade wird gestartet, um das Wachstum der Mikrobe zu verhindern. Neben Rezeptor-ähnliche Kinasen befinden sich in der Plasmamembran auch andere Proteine, die in der Pflanzenabwehr eine wichtige Rolle spielen. Wie diese Proteine mit anderen Proteinen interagieren und welche Bedeutung die Interaktion spielt, ist nur teilweise geklärt. Das übergreifende Ziel dieser Arbeit ist die Identifizierung von neuen physikalischen Interaktionspartnern von plasmamembran-lokalisierten Proteinen, denen eine Aufgabe bei der Pflanzenabwehr zukommt. Als Hauptmethode wurde das Split-Ubiquitin Hefe-Zwei-Hybrid-System genutzt. Dieses hefebasierte System wurde designt, um Protein-Protein-Interaktionen an der Plasmamembran zu identifizieren, wozu das klassische Hefe-Zwei-Hybrid-System nicht in der Lage ist. Zwei verschiedene Split-Ubiquitin Hefe-Zwei-Hybrid-Systeme wurden getestet und verschiedene cDNA-Bibliothek-Screens wurden durchgeführt. Es wurde eine Bibliothek verwendet, die aus Effektorproteinen des Mehltaupilzes Blumeria graminis f. sp hordei besteht. Diese Bibliothek wurde gegen Rezeptor-ähnliche Kinasen von Gerste und Weizen getestet, für welche eine Rolle in der Nicht-Wirts-Resistenz angenommen wird. Dabei konnten potenzielle Effektorproteine identifizieren werden, die mit zwei dieser Rezeptor-ähnlichen Kinasen interagieren, was im Hefesystem bestätigen werden konnte. Zusätzlich wurde das Split-Ubiquitin Hefe-Zwei-Hybrid-System für die Identifizierung von neuen Interaktionspartnern vom Gersten Mlo-Protein verwendet. Die biochemische Funktion dieses Proteins mit sieben Transmembrandomänen ist bis heute unklar, aber ein Ausschalten von bestimmten Genen dieser Familie führt zur kompletten Mehltauresistenz. Ein Interaktionsscreen wurde herangezogen, um neue Anhaltspunkte auf die biochemische Funktion zu bekommen. Hierbei konnten zwei potenzielle Interaktionspartner aus Gerste identifiziert werden, welche in der Zukunft noch weiter bestätigt werden müssen. Die Überexpremierung von einem Kandidaten - einer O-Methyltransferase - führt zur erhöhten Resistenz gegen Gerstenmehltau. Außerdem konnten zwei potenziell interagierende Effektorproteine bestimmt werden, wobei ein Kandidat (CSEP0515) nicht in BiFC Experimenten bestätigen konnte. Der zweite Effektor muss noch getestet werden. Zuletzt wurde das Hefesystem verwendete, um neue Interaktionspartner des Arabidopsis thaliana Chitin Rezeptors CERK1 zu identifizieren. In Hefe und in planta Split-Luziferase Experimenten konnte gezeigt werden, dass CERK1 mit Calmodulin, einer Plasmamembran H+ ATPase (AHA2) und dem Protein PCC1 interagiert. Die Funktion der Interaktion mit Calmodulin und AHA2 muss noch weiter untersucht werden. PCC1 gehört zu einer Proteinfamilie in Eukaryoten, die auf biotischen und abiotischen Stress reagiert. Es besitzt einen speziellen Bereich, welcher cystein-reicher-transmembran Bereich genannt wird. In silico Analysen und Interaktionsdaten weisen darauf hin, dass diese Familie Homo- und Heterodimere bildet und dass bestimmte Mitglieder ähnliche Expressionsmuster haben. Für die Interaktion mit PCC1 konnte folgendes gezeigt werden: 1. Die Interaktionsstelle in PCC1 konnte eingrenzt werden; 2. Es konnte gezeigt werden, dass auch andere Familienmitglieder mit CERK1 interagieren können; 3. Indizien für die Phosphorylierung des N-terminus von PCC1 konnten geliefert werden und 4. Es konnte gezeigt werden, dass auch andere Rezeptor-ähnliche Kinasen der Pflanzenabwehr, wie LYK4, LYK5, BAK1, EFR und FLS2 mit PCC1 interagieren können. Zwei Arabidopsis thaliana Mutantenlinien von PCC1 zeigten nicht aussagekräftigte ROS Burst Phänotypen. Eine knock-down Mutante zeigte eine reduzierte ROS Antwort, wenn Chitin oder elf18 verwendet wurde, wobei die knock-out Mutante wildtyp-ähnliche Antwort zeigte.

Plants possess a sophisticated immune system, which is capable of defending a plant against the vast majority of microbes. For the recognition of different microbes, plants use receptor-like kinases (RLKs) and receptor-like proteins (RLPs), which are localised at the plasma membrane. These receptors can bind microbe-specific molecules on the extracellular side and can transmit the signal by phosphorylation reactions into a cellular signal. A defence signalling cascade is started to prevent the growth of the microbe. Not only RLKs are present in the plasma membrane, but also other proteins that play a crucial role in plant immunity. How these proteins interact with other proteins and the meaning of this interaction is only partially solved. The overall aim of this thesis was the identification of new physical interaction partners of plasma membrane-localised proteins involved in plant immunity. The main approach that was used in this thesis was the split-ubiquitin yeast two-hybrid (Y2H) system. This yeast-based system was designed to identify protein-protein interactions at the plasma membrane, wherefore the classical Y2H system is not applicable. Two different split-ubiquitin Y2H systems were tested, and various cDNA library screens were performed. A library composed of effector proteins of the powdery mildew fungus Blumeria graminis f. sp. hordei (Bgh) was used to screen it against barley and wheat RLKs, which should have a proposed role in non-host resistance. Potential interaction partners with two of these RLKs could be identified and validated in yeast. The split-ubiquitin Y2H system was further applied for the identification of new interaction partners of the barley Mlo protein. The biochemical function of this seven transmembrane-containing protein is to date unknown, but a knock-out of specific genes of MLO family leads to complete powdery mildew resistance. The interaction screen should help to find new indications of the biochemical function. Two new potential interacting proteins of barley could be identified, which have to be further validated in the future. The overexpression of one of the candidates, an O-methyltransferase, leads to enhanced resistance against Bgh. Two potential interacting CSEPs could be determined, although one candidate (CSEP0515) could not be validated in an in planta bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays. The other effector needs to be tested. Finally, the yeast system was used for the identification of new interaction partners of the Arabidopsis thaliana chitin receptor CERK1. Yeast and in planta split-luciferase experiments validated that CERK1 interacts with calmodulin (CaM), a plasma membrane H+ ATPase (AHA2) and the protein PCC1 (PATHOGEN AND CIRCADIAN CONTROL 1). The function of the interaction of CaM and AHA2 needs further investigation in the future. PCC1 belongs to a family of biotic and abiotic stress response proteins in eukaryotes. It possesses a specific domain, which is called cysteine-rich transmembrane domain (CYSTM). In silico analysis and interaction data indicate that different CYSTM family members form homo- and heterodimers and that specific members show a similar expression pattern. For the CERK1-PCC1 interaction could be shown: 1. The potential interaction site of PCC1 was narrowed down; 2. It could be shown that also other family CYSTM members can interact with CERK1; 3. Indication of likely phosphorylation of the N-terminus of PCC1 could be revealed and 4. It could be displayed that also other RLKs involved in plant immunity, like LYK4, LYK5, BAK1, EFR and FLS2, can interact with PCC1. Two Arabidopsis mutant lines of PCC1 revealed an unfortunately inconclusive ROS burst phenotype. A knock-down mutant showed a reduced ROS response after chitin and elf18 trigger, whereas the knock-out mutant exhibited a wild type-like reaction.

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