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000785128 245__ $$aMetabolic engineering of Pseudomonas taiwanensis VLB120 for sustainable production of 4-Hydroxybenzoate$$cChristoph Lenzen$$honline, print
000785128 250__ $$a1. Auflage
000785128 260__ $$aAachen$$bApprimus$$c2020
000785128 300__ $$a1 Online-Ressource (XVIII, 153 Seiten) : Illustrationen, Diagramme
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000785128 500__ $$aAuch veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University
000785128 502__ $$aDissertation, RWTH Aachen University, 2019$$bDissertation$$cRWTH Aachen University$$d2019$$gFak01$$o2019-07-08
000785128 5203_ $$aDie aromatische Substanz 4-Hydroxybenzoat und ihre Derivate, die Parabene, finden breite Anwendung im alltäglichen Leben. Derzeitige Produktionswege für Aromaten wie 4-Hydroxybenzoat beruhen hauptsächlich auf chemischen Prozessen und benötigen hohen Einsatzan Energie und fossilen Ressourcen. Aufgrund der schwindenden Verfügbarkeit jener und des steigenden Bedarfs an Aromaten sowie nicht umweltfreundlichen Synthesewegen existiert eindringender Bedarf an effizienteren und nachhaltigen Produktionsprozessen. Die vorliegende Arbeit behandelt die Entwicklung eines Pseudomonas-basierten Ganzzellbiokatalysators für die Biokonversion von 4-Hydroxybenzoat aus erneuerbaren Rohstoffen wie Glucose oder Glycerin. Neben dem bemerkenswerten und vielseitigen Stoffwechsel dieser Organismen und der nativen hohen Toleranz gegenüber toxischen Substanzen wie organischen Lösungsmitteln wurde die Spezies Pseudomonas taiwanensis VLB120 als Produktionswirt ausgewählt, da sie die natürliche Fähigkeit besitzt, C5-Zucker wie Xylose zu metabolisieren und sie als nicht-pathogener Organismus angesehen wird. Frühere Versuche zur biotechnologischen Produktion von 4-Hdroxybenzoat mit Pseudomonaden oder anderen Wirten waren zwar erfolgreich, resultierten aber meist in geringen Ausbeuten oder benötigten aufgrund von Auxotrophien die Supplementierung zusätzlicher Metabolite. Daher war es das Ziel dieser Arbeit, die Bioproduktion von 4-Hydroxybenzoat in hoher Ausbeute und nur anhand einer spezifischen Kohlenstoffquelle zu ermöglichen. Um das gesamte Potenzial des Metabolic Engineering auszuschöpfen, wurden für die Stammentwicklung rationale sowie nicht-rationale Strategien angewandt. Durch Einführung eines heterologen Produktionsweges ausgehend von Tyrosin, die Eliminierung und Herunterregulierung konkurrierender Stoffwechselwege und die Überexpression von Schlüsselgenen produzierte der Stamm P. taiwanensis VLB120 CL4.3 4-Hydroxybenzoat mit einer C-mol Ausbeute von 19,0% aus Glucose, während der Stamm P. taiwanensis VLB120 CL3.3 während des Wachstums auf Glycerin in Batchkultivierung 29,6% erreichte und einen Titer 9,9 g l-1 in Fed-batch Fermentationen. Ein nicht-rationaler Ansatz zur verbesserten Produktion von 4-Hydroxybenzoat wurde durch zufällige chemische Mutagenese und anschließender Hochdurchsatzdurchmusterung mittels Durchflusszytometrie mithilfe eines fluoreszenzbasierten Biosensors durchgeführt. Der beste identifizierte Stamm, P. taiwanensis VLB120 CL2 gfp2 P2H08, produzierte 31% mehr 4-Hydroxybenzoat als der nicht mutierte Stamm. Obwohl weiteres rationales Engineering dieses Stammes nicht in verbesserter Produktion resultierte, dürften die eingeführten Mutationen dennoch wertvolle Einblicke für zukünftige Engineering-Ziele gewähren. Weiterhin wurde eine Verbesserung der 4-Hydroxybenzoat-Produktion durch die Nutzung des Metabolic-Demand-Konzepts erzielt. Dabei wurden die Hauptwege zur Bereitstellung von Acetyl-CoA basierend von Glucose disruptiert, während der Acetyl-CoA-bereitstellende Produktionsweg für 4-Hydroxybenzoat intakt gelassen wurde, um eine wachstumsgekoppelte Produktion zu gewährleisten. Auf Glucose als alleiniger Kohlenstoffquelle produzierte Stamm P. taiwanensis VLB120 CL5.4 4-Hydroxybenzoat mit einer C-mol Ausbeute von 21.0%, was die Vermutung stützt, dass das Metabolic-Demand-Konzept für eine effizientere Produktion von Aromaten genutzt werden kann. Die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse unterstreichen das große Potenzial von P. taiwanensis VLB120 als Wirt für nachhaltige, industrielle Biokonversion von Aromaten und stellen die Basis für weiteres Engineering dar, um die biotechnologische Produktion von wertvollen Substanzen als vielversprechende Alternative zu aktuellen chemischen Produktionswegen voranzutreiben.$$lger
000785128 520__ $$aThe aromatic compound 4-hydroxybenzoate and its derivatives, the parabens, find applications in everyday life. Current production routes for aromatics such as 4-hydroxybenzoate are mainly based on chemical catalysis and depend on the intensive use of energy and fossil resources. Due to the decreasing availability of the latter, the rising demand for aromatics and the non-ecofriendly way of formation, there is an urgent need for finding more efficient and sustainable syntheses. The present work focused on the development of a Pseudomonas-based whole-cell biocatalyst for the bioconversion of 4-hydroxybenzoate from renewable substrates such as glucose or glycerol. Besides the remarkable and versatile metabolism of this genus and its native high tolerance towards toxic compounds such as solvents, the species Pseudomonas taiwanensis VLB120 was chosen as a production host, since it accepts five carbon sugars such as xylose as sole carbon source and it is not regarded as a pathogenic organism. Former attempts to biotechnologically produce 4-hydroxybenzoate using different Pseudomonads and other species were indeed successful, but several studies resulted in only minor yields or required the supplementation of additional metabolites due to auxotrophies. Therefore, the objective was to enable high-yield 4-hydroxybenzoate biosynthesis solely from one specific carbon source. In order to exploit the full potential of metabolic engineering, rational as well as non-rational techniques were applied for host development. By introducing a heterologous production pathway based on tyrosine, eliminating and downregulating competing pathways and overexpressing key genes, strain P. taiwanensis VLB120 CL4.3 produced 4-hydroxybenzoate with a C-mol yield of 19.0% on glucose, whereas strain P. taiwanensis VLB120 CL3.3 reached 29.6% when grown on glycerol in batch mode, and a titer of 9.9 g l-1 during pulsed fed-batch fermentations. A non-rational approach for improved 4-hydroxybenzoate production was applied by random chemical mutagenesis and subsequent high-throughput screening via flow cytometry using a developed fluorescence-based biosensor. The best identified strain, P. taiwanensis VLB120 CL1gfp2 P2H08, produced 31% more 4-hydroxybenzoate than the non-mutated strain. Although further rational engineering of this strain did not result in better production performance, the introduced mutations can still give valuable insights into future engineering targets. Further improvement of production performance was achieved by exploiting the metabolic demand concept. In doing so, the main metabolic routes from glucose to acetyl-CoA were disrupted while leaving the acetyl-CoA generating 4-hydroxybenzoate production pathway intact in order to establish a growth-coupled production. On glucose as sole carbon source, stain P. taiwanensis VLB120 CL5.4 produced 4-hydroxybenzoate with a C-mol yield of 21.0%, supporting the assumption that the metabolic demand concept can be used for more efficient aromatics production. The results gained in this work underline the huge potential of P. taiwanensis VLB120 as a host for sustainable industrial bioconversion of aromatics and may be the basis for further engineering in order to promote the biotechnological formation of valuable compounds as a promising alternative to current chemical production routes.$$leng
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